细胞自噬研究概览

王懿峥，陈扬，俞立†

①清华大学生命科学学院PTN项目，北京 100084；②清华大学-北京大学生命科学联合中心，清华大学生命科学学院生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京 100084

细胞自噬研究概览

王懿峥①②，陈扬②，俞立②†

①清华大学生命科学学院PTN项目，北京 100084；②清华大学-北京大学生命科学联合中心，清华大学生命科学学院生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京 100084

自噬(autophagy)是一种细胞通过溶酶体或液泡(酵母)，将受损的或多余的细胞组分降解形成生物小分子的细胞代谢过程，在真核生物中十分保守，而其正常与否也与人类的身体健康密切相关。在距Christian de Duve发现溶酶体并提出自噬这个概念50多年后，日本分子细胞生物学家大隅良典因对自噬机制的阐明做出的重大贡献而获得了2016年度诺贝尔生理学或医学奖。本文旨在回顾自Christian de Duve发现溶酶体至今自噬领域的发展历程，并介绍中国的研究现状。

自噬；研究史；大隅良典

2016年，日本科学家大隅良典(日文：おおすみよしのり，英文：Yoshinori Ohsumi)因在细胞自噬机制研究方面做出的重大贡献获得诺贝尔生理学或医学奖[1]。自噬这一概念，最早是由溶酶体的发现者、著名的细胞生物学家Christian de Duve在1963年提出的。本文回顾了自发现溶酶体至今自噬领域的发展历程，并介绍国内的研究现状。

1 什么是自噬

对细胞来说，对环境中的营养水平进行响应，并充分利用胞内物质与能源是一门“必修课”，而自噬就是其中一种手段。自噬是一种介由溶酶体或液泡(酵母)而进行的具有或非选择性的细胞组分降解，产生能量或生物小分子的细胞生理过程，并在真核生物中具有很高的保守性。自噬一般被分为三种类型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。微自噬通过直接的溶酶体膜或液泡膜内陷或突出，进而吞食部分胞质；而巨自噬则是通过生成一种独立的双层膜结构——自噬体(autophagosome)包被胞质组分并运至溶酶体或液泡；CMA则是介由分子伴侣进入溶酶体[2]。

自噬还可以根据其是否选择性降解某些底物分为选择性自噬(selective autophagy)和非选择性自噬(non-selective autophagy)。常见的选择性自噬包括Cvt (cytoplasm to vacuole targeting)通路、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、内质网自噬(ER phagy)及异体吞噬(xenophagy)等等[3]。

2 自噬的发现和提出

作为细胞“消化器官”的溶酶体，是在20世纪50年代被发现的。

1955年，比利时生物学家Christian de Duve等[4]在将大鼠肝脏细胞裂解物多重离心之后所获的沉淀进行了一系列的酶学检测，发现其中含有酸性磷酸酶、核酸酶以及β-葡萄糖醛酸苷酶等水解酶。因此，他根据其功能特点，将这一新发现的细胞器命名为“溶酶体(lysosome)”，意为“降解体(digest body)”。

电镜的发展与应用极大地促进了人们对溶酶体的认识和理解。在1956年，Alex B. Novikoff等[5]通过电镜不仅观察了纯化所得溶酶体的结构，而且还在大鼠肝脏组织切片中观察到了类似的结构，进一步说明了溶酶体是一类真实存在的细胞器。

对溶酶体的形态学研究也促进了对其功能的理解。相关学者先后在内吞作用活跃的巨噬细胞和白细胞中发现了大量的溶酶体，并发现内吞形成的囊泡终究会与溶酶体融合[6]。

对溶酶体深入的研究也促使了自噬现象的发现。细胞外的物质可以通过内吞被细胞摄取并通过溶酶体被降解，而胞内组分降解的细节在当时就鲜为人知[7]。

1957年，S. L. Clark[8]在观察新生小鼠肾脏细胞分化时，意外地观察到了在细胞质中存在着一些无固定形状的、包裹着一些致密的片层结构，甚至是线粒体的囊泡结构。

1962年，T. P. Ashford和K. R. Porter[9]在用胰高血糖素处理大鼠肝脏后发现在肝脏细胞中产生了大量包裹着细胞组分的溶酶体。他们还发现线粒体更容易被溶酶体包裹。

基于大量的观察和形态学研究，C. de Duve在1963年提出了“自噬(autophagy)”的概念[10]。

1968年，A. U. Arstila和B. F. Trump[11]通过利用胰高血糖素诱导自噬，发现了一种包被着细胞组分却无水解酶的双层膜结构，即自噬体(autophagosome)和另一种含有多种水解酶的单层膜结构，即自噬溶酶体(autophagolysosome)。通过总结前人和自己所观察到的现象，他们绘制出的自噬相关囊泡的形成和互作的示意图，使得人们对自噬的了解更加深入。

3 自噬的诱导和抑制

对自噬进行系统的研究，其诱导及抑制系统的建立在当时则显得格外重要。

上文中所提及的T. P. Ashford和K. R. Porter在1962年的工作中，利用胰高血糖素来诱导大鼠肝脏细胞产生了大量的溶酶体。

1967年，R. L. Deter及C. de Duve[12]受到Ashford和Porter工作的启发，发现胰高血糖素可以诱导肝脏细胞发生自噬，为后续对自噬生理功能等方面的研究提供了很好的模型。

1976年，G. E. Mortimore和W. F. Ward[13]在研究大鼠肝脏蛋白质降解机理的过程中发现，氨基酸水平参与调解该过程。当氨基酸浓度较高时，蛋白质降解则受到抑制；反之，则促进蛋白质降解。

1980年，P. O. Seglen等[14]重复了G. E. Mortimore和W. F. Ward的工作，并发现亮氨酸和天冬酰胺共同使用时对自噬的抑制效果最佳。

1982年，P. O. Seglen和P. B. Gordon[15]发现3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)对细胞内源蛋白的降解有明显的抑制作用，并通过电镜观察发现细胞内自噬体的形成也受到了明显抑制。因此，他们认为3-MA是一种自噬抑制剂，而3-MA本身也成为一种至今仍被广泛使用的自噬抑制剂。

氨基酸饥饿和3-MA的发现使得科学家们找到了诱导自噬和抑制自噬的方式，使进一步研究自噬的机制和生理功能变成了可能。

4 APG基因的发现

如果想对某一生理过程进行研究，只停留在观察现象是远远不够的，所以当时的学者们开始了对自噬基因层面的研究。但是很明显，较长的生命周期和较差的繁育能力，使得动物模型并不是进行遗传筛选的最佳选择。

日本学者大隅良典选择利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)这一模式生物进行遗传筛选，以期筛选到一系列自噬缺陷菌株。酿酒酵母的细胞质中存在着一个巨大的单层膜囊泡结构，即液泡(vacuole)，其中富含氨基酸和各种离子等营养物质，而且还含有多种水解酶，因此一般将其等同于哺乳动物细胞的溶酶体。

1992年，大隅良典实验室的K. Takeshige等[16]发现缺乏蛋白酶A、B及羧肽酶Y的细胞在氮源或碳源饥饿之后，利用电镜观察到酵母液泡中有很多囊泡状结构，即自噬小体(autophagic body，翻译为自噬小体是以期与自噬体autophagosome区别开来)，且该现象可以通过普通的相差或Nomarsky显微镜直接观察，这就为后续的遗传筛选提供了一个很好的工具。其中pep4Δ菌株至今仍是研究自噬缺陷重要的工程菌之一。

1993年，M. Tsukada和Y. Ohsumi[17]利用上述现象进行了一系列的自噬缺陷突变菌株的筛选。他们采取了两种方法：一是将诱变产生的菌株进行碳源饥饿再通过显微镜观察；二是将诱变产生的菌株影印至含有焰红染料B(phloxine B)的氮源饥饿平板上，挑选变为红色的菌株再被含有苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，PMSF可以使野生型菌株模拟出蛋白酶缺陷型菌株在饥饿之后的液泡中富集自噬小体的表型)的无氮源培养基饥饿后通过显微镜观察。两者皆是以液泡中未观察到自噬小体为目标菌株。

通过上述的方法，他们首先筛得了两个突变菌株，发现这两个突变是位于同一个等位基因，并将该基因位点命名为APG1(AutoPhaGy 1，即现在的ATG1)。利用这种方法，他们一共找到了15个基因，并将它们依次名命名为APG1～APG15。

经过进一步的研究发现，这些基因缺陷型的菌株在生长增殖方面并未表现出明显的缺陷，但在氮源饥饿之后它们的生存能力受到了巨大影响。这也是方法二中初筛的原理。

1997年，大隅良典实验室的A. Matsuura等[18]发现APG1编码一种新型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，且其激酶活性是自噬所必需的。

毋庸置疑，自噬相关基因的发现也极大地推进了自噬机制在分子水平上的研究。可以说，没有大隅良典的工作，自噬领域就不可能发展到今天的水平。

5 Cvt通路的发现

几乎与大隅良典同时(1992年)，在太平洋彼岸美国的D. J. Klionsky等[19]发现酿酒酵母基因APE1所编码的氨基肽酶I (aminopeptidase I， API)前体必须被送至液泡，且该过程依赖于基因PEP4。

1995年，D. J. Klionsky实验室的T. M. Harding等[20]利用遗传诱变筛选的方法，找到了一系列使得API前体(pro-API)无法被转化为成熟的API蛋白(mAPI)的基因，并将其命名为CVT1至CVT8(其中CVT4及CVT8被认为分别是已被发现的VPS家族的VPS39及VPS41)，而该通路则被命名为细胞质至液泡的寻靶[21](cytoplasm to vacuole targeting，Cvt)通路。

先于细胞质中形成的囊泡定向与液泡融合，其内容物可以被液泡中的蛋白酶降解。Cvt通路的这一特点，让D. J. Klionsky意识到，Cvt通路可能与自噬有关。但同时他们也意识到，自噬发生于营养匮乏时，而Cvt通路大多是在营养充足的情况下进行，所以两者也存在着固有的不同。

于是殊途同归，在1997年，D. J. Klionsky与大隅良典实验室[22]合作阐明了Cvt通路和经典自噬的区别与联系。

2003年，为了自噬领域更好地进行研究交流和讨论，D. J. Klionsky、大隅良典及其他自噬领域的同仁[23]联合发文，统一了自噬相关基因在酿酒酵母中的命名方法，即ATG相关基因(AuTophaGy related genes)。这一次命名的统一不仅总结了过去十几年对自噬相关基因的一系列研究工作，还为接下来的研究消弭了很多不必要的麻烦，从此自噬领域进入了高速发展时代。

6 自噬机制的研究时代

在大量与自噬相关的基因被鉴定之后，科学家们十分急迫地想了解，这些基因与基因、基因与自噬之间到底是一种怎样的关系，于是自噬机制的研究如火如荼地进行开来。这其中最有名的莫过于两大类泛素化系统的发现。

首先是Atg12p-Atg5p类泛素化系统。

1998年，大隅良典实验室的N. Mizushima等[25-26]，在利用蛋白质免疫印迹手段检测带有HA标签的Atg12p(当时还叫Apg12p，31.0～32.5 kD)时，发现在约70 kD的位置上多出来了一条带。通过进一步的研究发现，这是由于Atg5p与Atg12p结合形成类泛素化系统稳定的结构而导致的。尔后通过查询数据库，在人类细胞系中找到了Atg12p的人类同源物hAtg12，发现在人类细胞中也存在着同样的系统。

1999年，N. Mizushima等[27]又发现Atg12p-Atg5p的功能与Atg16p息息相关。Atg16p在形成Atg12p-Atg5p-Atg16p异源多聚体时行使连接功能；2001年，N. Mizushima等[28]发现Atg5p定位于隔离膜(isolation membrane)，且其与Atg12p结合的有无并不影响其定位；N. Mizushima等[29]又于2003年在小鼠中鉴定了与Atg5相互作用、与酵母Atg16p同源的Atg16L。

其次便是Atg8p-PE类泛素化系统。

1999年，T. Kirisako等[30]发现自噬发生后Atg8会与隔离膜紧密相连，且该过程依赖于Atg4；紧接着2000年，T. Kirisako等[31]发现通过Atg4p切去Atg8p的甘氨酸残基后，再经E1样酶Atg7p、E2样酶Atg3p形成Atg8p-X复合物；同年，Y. Ichimura等[32]发现所谓的X是磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)。

2000年，Y. Kabeya等[33]发现酵母Atg8p哺乳细胞同源物LC3，在被翻译后加工为LC3-II后，会定位在自噬体及自噬溶酶体上。2004年，N. Mizushima等[34]将LC3/Atg8当作一种标记应用于观察小鼠不同组织细胞在不同营养条件下的自噬情况。

与此同时还有Atg1-Atg13、PI3P复合体等自噬调节机制的发现，使得人们对自噬的理解更加深入。

7 疾病时代

自噬的分子机制被逐渐阐明的同时，有一波科学家开始将目光有意无意地转移到自噬与人类疾病的关系上来，从而开启了自噬的“疾病时代”。

早在1999年，B. Levine实验室的X. H. Liang等[35]就发现酵母Atg6p的哺乳同源物Beclin 1可以抑制人类乳腺癌细胞系MCF7的增殖和在裸鼠中的成瘤过程。

2000年，A. Petiot等[36]在HT-29细胞中发现，PI3K直接参与细胞自噬过程；2001年，S. Arico等[37]发现肿瘤抑制因子PTEN通过抑制PI3K/蛋白激酶B通路来正向调控自噬；2001年，K. Podsypanina等[38]发现雷帕霉素的类似物可以通过抑制mTOR的活性来减缓PTEN缺陷小鼠体内肿瘤的形成。也正因此，在2002年时，雷帕霉素的类似物CCI-779和RAD-001被运用于临床试验[39-40]。

2003年，B. Levine实验室的X. Qu等[41]进一步发现beclin 1的杂合敲除即可增加小鼠体内形成恶性肿瘤的几率，促进细胞增殖。所以他们认为自噬可能调控肿瘤的形成。

2006年，N. Mizushima实验室的T. Hara等[42]发现Atg5敲除小鼠神经细胞在发育过程中存在渐进的损伤，并在其神经元的细胞质中发现内含体的积累。因此他们推断，自噬可能通过降解不正常蛋白，避免其积累来保证神经细胞的正常发育。

除去对传统自噬异常导致的疾病的研究，科学家们对选择性自噬与疾病关系的研究也越发深入。p62及Tollip等一系列重要的适配蛋白就此被发现。

2007年，M. Komatsu等[43]发现p62参与调控内含体的形成，且敲除p62可以显著缓解因自噬缺陷而导致的对肝细胞的损伤。所以自噬可能是通过调节p62的水平来调控内含体的形成。有趣的是，同年S. Pankiv等[44]发现p62不仅参与内含体的形成，还可以通过与泛素和LC3互作，将蛋白聚集体降解。

2014年，K. Lu等[44]在酿酒酵母中发现了类似于哺乳细胞中的p62，通过与Atg8p及泛素互作，降解蛋白聚集体，却不与p62同源的Cue5，并且在哺乳细胞中找到其同功同源物Tollip。进一步的研究发现，Tollip可以通过选择性自噬降解富谷氨酰胺蛋白来避免亨廷顿症(Huntington’s disease)。

自噬同人类健康和疾病之间极为密切的联系，也让人们开始认识到自噬其重要性。然而在用药和监控方面，自噬相关疾病的治疗还任重而道远[45]。

综上所述，我们可以将大隅良典对于自噬领域的贡献总结为以下三个方面：①发现了ATG系列基因，不仅阐释了自噬的分子机制，还为科学研究提供了阻抑自噬的手段；②发明了一系列检测自噬水平的技术手段，例如GFP-Atg8p剪切实验及观测GFP-Atg8p进入液泡的情况等等；③为自噬领域培养了一大批科学人才，包括发现了Atg5p-Atg12p类泛素化系统的N. Mizushima，发明了Pho8Δ60分析的T. Noda，以及发现自噬体标记蛋白LC3的T. Yoshimori等等。

8 自噬与中国

我国在自噬领域起步较晚，但经过多年的努力建设，我国的细胞自噬研究也已有长足发展，得到国际同行的广泛关注和认可，在多个分领域已达到国际领先水平。

中国科学院生物物理研究所张宏研究员[46-49]鉴定了一系列多细胞生物特异的自噬新基因并阐明其作用机制，建立了以多细胞生物线虫为模式生物研究发育过程中自噬活性调控机制的模型。浙江大学医学院刘伟教授[50-52]致力于研究乙酰化/去乙酰化对自噬的影响、能量胁迫诱导的新自噬通路的分子调控机制和生理意义。中国科学院动物研究所陈佺研究员[59-60]对线粒体选择性自噬有深入的研究。清华大学生命科学学院刘玉乐教授[61-62]鉴定了植物新自噬通路——叶绿体自噬，并在自噬调控植物先天免疫分子机制研究中取得重要进展。北京大学基础医学院陈英玉教授[63-64]在新自噬分子的鉴定及其在肿瘤和自身免疫病中的作用研究中做出贡献。上海交通大学生命科学技术学院谢志平研究员[65-66]致力于自噬早期事件的研究。中国科学院遗传与发育生物学研究所杨崇林教授[67]长期致力于溶酶体介导的蛋白质降解通路的调控机制研究，同时在实验室中大力开展了自噬晚期溶酶体事件的研究。上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所胡荣贵研究员[68]注重蛋白质稳态平衡的研究，并尤其偏重于蛋白质降解途径中自噬途径的研究。我们实验室发现自噬性溶酶体再生这一标志自噬末期的细胞生物学过程，对其进行了系统的研究(autophagic lysosome reformation, ALR)[53-58]，并利用酵母对自噬的调控进行了深入的研究。

同时，多名中国科学家在Gordon Conference、Cold Spring Harbor、the Zing Conference、ISA、Keystone、EMBO Workshop等国际著名会议中担任主席、分会主席或者受邀发表报告，影响力已不容小觑。俞立教授受邀作为2014年Keystone会议、2016年冷泉港亚洲会议的共同组织者，并被选为2020年Gordon国际自噬会议的主席。张宏研究员作为主席组织召开了2015年第七届国际细胞自噬会议。目前国内已经形成了以中年科学家为核心、青年科学家为骨干的研究队伍，并逐步吸引领域相关人才的加入，具有一定的研究规模，成功搭建了重要的实验体系和实验平台，建立了多种研究模型。此外还有一批海外归国的青年科学家加入了自噬的研究队伍。因此，当前正是中国科学家对于自噬在多细胞生物中应对多种胁迫条件的功能和生理学意义开展研究的关键时机。

(2016年12月6日收稿)

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(编辑：段艳芳)

Brief history of autophagy research

WANG Yizheng①②, CHEN Yang②, YU Li②
①PTN Program, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; ②State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Tsinghua University-Peking University Joint Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Autophagy is an evolutionarily conserved, lysosome based degradation process which plays important roles in various physiopathological conditions. Since Christian de Duve discovered lysosome, it has takenfour decadesfor autophagy researchers to reveal the basic mechanisms of autophagy. In 2016, Japanese biologist Yoshinori Ohsumi was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine, for his discoveries of mechanisms for autophagy. In this review, wesummarized the key events in the development of autophagy research.

autophagy, brief history, Yoshinori Ohsumi

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.06.003

†通信作者，国家杰出青年科学基金获得者，主要研究新细胞器迁移体(migrasome)的机制与功能、自吞噬在细胞及分子水平上的调控机制。E-mail: liyulab@mail.tsinghua.edu.cn