鲤I-IFN-γ作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究

于慧，张瑞雪，王好，周井祥*，刘艳辉

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;2.吉林省水产科学研究院，长春130033)

鲤I-IFN-γ作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究

于慧1，张瑞雪1，王好1，周井祥1*，刘艳辉2*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;2.吉林省水产科学研究院，长春130033)

为了研究鲤Ⅰ-IFN-γ的免疫效果，根据鲤Ⅰ-IFN-γ的mRNA基因序列(GenBank)，构建真核表达质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ，重组表达质粒与不同剂量的转染试剂EndoFectionTM Max混合后转染鲤鱼肌肉细胞，通过荧光倒置显微镜观察，重组表达质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ在细胞中成功表达。以多种免疫剂量的重组表达质粒与pIRES-ORF81混合对鲤鱼进行肌肉注射，每周免疫一次，共免疫三次，免疫前采血，收集血清，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体水平。结果表明：于第三次免疫后两周，抗体水平达到最高，联合免疫与单独免疫核酸疫苗pIRES-ORF81相比，抗体水平明显升高，但差异不显著(P>0.05)。鲤Ⅰ-IFN-γ作为锦鲤疱疹病毒的免疫佐剂具有一定的免疫效果。

鲤I型γ干扰素；锦鲤疱疹病毒；核酸疫苗pIRES-ORF81；免疫效果

锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)能够引发鲤鱼发生高致病性的锦鲤疱疹病毒病(Koi Herpesvirus Disease，KHVD)，病毒传播迅速，致死率极高。世界动物卫生组织(OIE)已经将KHVD列为必需报告的疾病[1]。目前仍然没有治疗该病的特效药物，只能通过相关免疫手段对其进行预防，接种疫苗被认为是水产病毒性疾病预防和治疗的最适当方法，单一疫苗对鱼的免疫效果并不能达到预期目标。因此，利用佐剂或免疫刺激剂来增加疫苗功效是一种新的途径。

干扰素(Interferon, IFN)是一种重要的细胞因子，可作为生化制剂类免疫佐剂，具有抗病毒功效，能在病毒感染后迅速起效[2]。细胞和机体通常需要病毒、核酸、细菌内毒素等刺激才能产生干扰素。Ⅰ型干扰素γ(Ⅰ-IFN-γ)是发展先天免疫反应的重要组份[3]。它可激活IFN刺激因子(ISGs)转录，编码不同的抗病毒蛋白，释放抗病毒物质，干扰病毒复制、增殖，调节机体细胞分化[4]、生长[5]。

尽管在鱼类的干扰素活性很久以前就被人所知，但直到2003年三种鱼的Ⅰ-IFN-γ才被克隆，分别为斑马鱼[6](Daniorerio)，大西洋鲑(Salmosalar)[7]和河豚鱼。目前已经在部分硬骨鱼中克隆到了Ⅰ型IFN基因，其中包括，鲶(Ictaluruspunctatus)[8]，虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[9]，黑鲈(Micropterussalmoides)[10]，三棘鱼(Gasterosteusaculeatus)[11]，牙鲆(Paralichtsolivaceus)[12]，舌齿鲈(Diceutrarchuslabrax)[13]，鲤(Capriuscarpio)[14]，石斑鱼(Epiuephelusseptemfas-ciatus)[15]，大黄鱼(Larimichthyscrocea)[16]等，并发现其中鲤、石斑鱼、舌齿鲈的Ⅰ型IFN-γ基因在鱼体抗病毒过程中起到重要作用。鱼的Ⅰ-IFN-γ有独特的基因组，5个外显子，4个内含子结构，这点是有别于其它物种的关键[17]。

在病毒感染鱼的初期，Ⅰ-IFN-γ是发展先天免疫反应重要组份[3]。通过病毒感染细胞产生和释放Ⅰ-IFN-γ导致IFN刺激因子的(ISGs)激活和转录，编码不同的抗病毒蛋白，通过抗病毒物质干扰病毒复制，抗增殖和免疫调节活动[18]。关于Ⅰ-IFN-γ反应在鱼类异疱疹病毒科中了解比较少[19]。在体外研究中，CyHV-3有能力抑制源于鲤鱼脑细胞(CCB)的成纤维细胞中Ⅰ-IFN-γ反应，在头肾白细胞(HKL)中并无此现象。但如果先用多聚肌苷酸胞苷酸(poly I: C)刺激CCB细胞，激活Ⅰ-IFN-γ反应，通过细胞单层培养，发现这样能够减缓CyHV-3传播速度。体外研究发现，CyHV-3感染时，皮肤和肠中IFN编码的基因表达上调[20-21]。

本研究选择构建pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ真核表达质粒，研究pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ与PIRES-ORF81核酸疫苗组成的联合制剂的免疫原性，为KHVD疫苗的研制提供新的思路。

1 材料

1.1 动物 150条健康鲤鱼，体重为150～200 g，购自新立湖的渔场，在25℃水族箱饲养2周后再进行试验。

1.2 质粒和病毒 重组质粒PIRES-ORF81由本试验室保存[22]，KHV阳性血清由本试验室保存[23]。

1.2 主要试剂 焦磷酸二乙酯(DEPC),北京鼎国公司;反转录试剂,TaKaRa;DL5000 Marker,DL2000 Marker，pMD18-T Vector，限制性内切酶，T4DNA连接酶,TaKaRa公司;DNA凝胶回收试剂盒,AxyGen公司;质粒转染试剂EndoFectinTM-Max,长春维尔特科技有限公司;羊抗鼠IgG-HRP,上海信然生物技术有限公司;抗鲤鱼IgM单克隆抗体,AQUATIC Diagnostic Ltd。

2 方法

2.1 鲤Ⅰ-IFN-γ基因的引物设计与合成 根据GenBank上登录的鲤Ⅰ-IFN-γ基因序列，用Primer Premiers 5.0软件设计引物，上游引物P3序列：5’-GAGCTCAATTTGAGAAAAAAATCGTAACAAA-3’ ；下游引物P4序列：5’-AAGCTTAATTTGAGAAAAAAATCGTAACAAA-3’ ；划线部分依次为限制性酶切位点SacⅠ和HindⅢ，送去生工(上海)公司合成引物。

2.2 Ⅰ-IFN-γ基因的扩增 试验所用器材需提前用DEPC水处理，取新鲜鲤鱼头肾样品及脾脏样品充研磨成粉末状待用，用TRIzol法提取RNA并进行反转录。产物用于PCR扩增，基因扩增体系为25 uL，用梯度PCR仪摸索最适退火温度，确定PCR反应条件为：95 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性 30 s，61.5 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环，72 ℃ 10 min，反应结束 4 ℃ 保存。

2.3 Ⅰ-IFN-γ基因的克隆及鉴定 将回收的Ⅰ-IFN-γ目的基因连接至pMD-18T克隆载体，将连接产物转入大肠杆菌DH5α菌种，向含Amp的固体LB平板中涂100 μL上述菌液，恒温(37 ℃)过夜培养，挑取的白色单个菌落接种于液体培养基中，碱裂解法提取质粒，用SacⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，阳性质粒送到生工(上海)进行基因测序，命名为pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ。2.4 构建重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ 将目的基因Ⅰ-IFN-γ与pEGFP-N1载体16 ℃过夜连接。转入DH5α感受态细胞内，向含Kana液体LB培养基内加入挑取的单菌落，160 r/min震荡培养(37 ℃，12～14 h)，碱裂解法提取质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定，选取阳性质粒命名为pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ并送至生工(上海)进行测序。

2.5 重组质粒的体外表达

2.5.1 重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ的大量提取与纯化 将pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ质粒的菌液进行划线培养，挑单一白色菌落至液体培养基中振荡培养至对数生长期，之后进行菌液的扩摇，收集菌体进行质粒大量提取，采用质粒大提试剂盒，方法参照AxyGen质粒大量说明书。使用分光光度计测定重组表达质粒在260 nm波长时的吸光值，根据重组表达质粒的浓度计算公式：质粒浓度(μg/μL)=OD260×稀释倍数×50 μg/mL。2.5.2 重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ的转染 将重组表达质粒、EndoFectionTM Max试剂和L-15培养基静置使之升至室温。用L-15培养基分别稀释重组表达质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ和转染试剂EndoFectionTM Max，稀释后室温静置5min。将稀释后的重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ于不同浓度的转染试剂EndoFectionTM Max充分混匀，室温静置5～20 min形成DNA-EndoFectionTM复合物。向每个细胞培养孔中逐滴加入DNA-EndoFectionTM复合物，边滴加边轻柔前后晃动培养板。操作时，应避免把转染试剂直接滴在细胞生长的位置.在26 ℃培养箱中孵育细胞，转染24 h后在荧光倒置显微镜下观察转染情况并采集图片。分别提取细胞(转染后)总RNA，方法与提组织RNA相似，再进行RT-PCR及PCR。

2.6 重组质粒与核酸疫苗联合免疫体内试验 免疫试验前，随机挑选11尾试验鱼进行KHVD的检测，PCR检测呈阴性后，将鱼分6组，每组10尾(表1)。注射剂量均稀释为200 μL/尾，三次免疫间隔14 d。

表1 鲤鱼免疫分组及免疫剂量

2.7 重组表达质粒诱导鲤的免疫效果检测 尾静脉采血于免疫前，在一免及二免后第一周，三免后一到三周。标记的灭菌EP管中贮存采取的血液，静置(37 ℃，2 h)，4 ℃过夜，隔天离心6000 r/min(4 ℃，15 min)，收集血清后贮存于-20 ℃，用于ELISA检测。在96孔酶标板中，用包被液将纯化后的病毒液稀释，每孔100 μL，4 ℃放置一夜洗涤后加入封闭液(新鲜配制的脱脂牛奶)，置于22 ℃，孵育2 h后，再次洗涤，然后加入待测血清22 ℃孵育3 h；洗涤5次后加入单克隆抗体22 ℃孵育1 h；洗涤5次后加入酶标二抗22 ℃孵育1 h；再次洗涤5次，加入100 μL底物溶液，22 ℃孵育10 min；再加入50 μL终止液；最后将酶标板放入酶标仪中，测定在OD 450 nm时的ELISA数据，记录结果。

3 结果

3.1 Ⅰ-IFN-γ的PCR扩增 分别以提取的鲤鱼头肾RNA及脾脏RNA为模板，反转录为cDNA后，再分别以Ⅰ-IFN-γ的P1，P2序列为引物，通过PCR扩增得到552 bp的预期大小的目的片段，如图1所示。

M： DNA分子量标准；1-3：PCR产物(Ⅰ-IFN-γ);4：阴性对照图1 Ⅰ-IFN-γPCR扩增产物

3.2 Ⅰ-IFN-γ基因克隆质粒的鉴定 用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ对pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ阳性质粒进行双酶切鉴定。结果显示在552bp位置有条带，同时有一条2000bp以上条带。与预期相符，说明pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ质粒构建成功，如图2所示。

M：DNA分子质量标准；1：双酶切产物(pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ)图2 双酶切鉴定pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ

3.3 重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ鉴定 分别用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ对阳性重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ进行双酶切鉴定。结果显示的目的片段大小与预期结果相符，在552 bp位置有条带，同时各有一条片段大小为4645 bp的载体条带。进一步说明已经成功将Ⅰ-IFN-γ基因克隆到pEGFP-N1真核表达载体上，如图3所示。

M：DNA分子质量标准；1： pEGFP- N1-Ⅰ-IFN-γ酶切结果图3 酶切鉴定重组质粒pEGFP-IFN-N1-Ⅰ

3.4 重组表达质粒浓度 根据2.9.2中的计算方法计算pEGFP-N1-IL-10，pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ和PIRES-ORF81的浓度分别为0.85、0.9、0.8μg/μL。

3.5 重组表达质粒的转染 根据2.1中所述步骤，将重组质粒pEGFP-N1-IL-10和pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ转染至锦鲤鳍条细胞中，在倒置荧光显微镜下可观察到有质粒成功转入细胞，如图4所示。

3.6 RT-PCR检测真核表达质粒的转染情况 转染成功后的细胞用Trizol裂解，提取细胞总RNA，RT-PCR，以cDNA作为模板，用P1，P2作为引物进行PCR检测。电泳位置在552 bp处观察到目的条带，说明pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ已转染成功，如图5所示。

1：重组质粒的pEGFP-Ⅰ-IFN-γ转染结果图4 重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ的转染结果

M：DNA 分子质量标准；1：阴性对照;2:Ⅰ-IFN-γPCR产物图5 Ⅰ-IFN-γ基因的PCR扩增结果

3.7 鲤鱼组织的PCR检测 在试验鲤鱼中随机挑选任意11尾，模板：组织基因组，阳性对照：KHV，图6为试验结果，11尾鱼的检测结果呈阴性，可以进行下一步试验。

1：阳性对照；2-12：鲤鱼组织DNA的PCR结果；M：DNA分子质量标准图6 鲤鱼组织PCR检测结果

3.8 鲤鱼血清中抗体水平ELISA检测结果 注射前要进行一次采血，再向不同试验组鲤鱼注射分别注射对应的免疫剂，一免及二免后一周，三免后第一至三周，尾静脉采血。通过间接ELISA法检测注射免疫剂后鲤鱼血清中的抗体水平。通过平均数和标准差的计算，最终得出表中数据。表2为结果。

表2 鲤鱼血清抗体水平检测(OD450)

依表所见，除了PBS组和空白组，其它各组鲤鱼血清中均能检测出KHV特异性抗体，免疫次数增多抗体水平随之增加。三免后两周，抗体水平达到峰值，之后趋于下降。增加质粒浓度抗体水平稍有增加，但不明显。PBS组和空白组这两组与注射重组质粒组的抗体水平差异明显(P<0.05)。

根据间接ELISA检测试验结果绘制折线图(图7)，可知混合制剂pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ+pIRES-ORF81相比单一核酸疫苗pIRES-ORF81抗体水平有所升高，但差异不显著(P>0.05)。

图7 各组的血清抗体水平折线图

根据间接ELISA检测试验结果，绘制各组的抗体水平的曲线，得出的免疫剂量为5 μg时，就可达到较好的抗体水平，随着免疫剂量的增加，抗体水平有所升高。

4 讨论与小结

硬骨鱼的干扰素具种属特异性，某种鱼的干扰素对其它鱼类抗病毒无作用。目前，已经鉴定了干扰素Ⅰ型对许多病毒的反应[24]。其中重组斑马鱼、鲶鱼[25]、草鱼、虹鳟[26]的干扰素都具有抗病毒的活性。在抑制病毒复制方面，干扰素Ⅰ型扮演了重要角色，可诱导蛋白表达，抑制病毒mRNA翻译，增加宿主细胞的抵抗力，并能够在感染早期限制病毒传播和扩散。在机体抗病毒的非特异性免疫应答中起重要作用。

以Ⅰ-IFN-γ的上述特性为依据，为了探索其是否适合作为免疫佐剂，与锦鲤疱疹病毒病的疫苗联合使用，我们进行了体外细胞转染实验，以探究目的蛋白是否能在体外锦鲤鳍条细胞中表达，通过倒置显微镜观察和RT-PCR检测，重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ成功转入了锦鲤鳍条细胞中，说明重组质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ能在细胞中正确表达，为接下来的体内试验提供参考依据。

体内试验选用生长发育较快的幼鱼，意在降低核酸疫苗的剂量，另外希望能让外源基因在宿主体内大量表达。免疫的最佳用量可根据鱼的大小不同进行调整。本试验采取肌肉注射的免疫方法，将联合免疫制剂pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ+pIRES-ORF81注射入试验鱼体内，相比单一核酸疫苗pIRES-ORF81，联合免疫制剂所产生的抗体水平更高，免疫效果更好。

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(编辑：陈希)

Immune Effect of Carp I-IFN-γ as Koi Herpesvirus Nucleic Acid Vaccine Adjuvants

YU Hui1, ZHANG Rui-xue1, WANG Hao1, ZHOU Jing-xiang1*, LIU Yan-hui2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.JilinProvinceFisheryScienceInstitute,Changchun130118,China)

Study on the carp Ⅰ-IFN-γ immune effect, on the basis ofⅠ-IFN mRNA gene sequence Genbank login, The eukaryotic recombinant plasmid pEGFP-N1-Ⅰ-IFN were constructed.Mixing recombinant expression plasmid and transfection reagents in several immune dose transfected carp muscle cells. The expression of recombinant expression plasmid pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ in carp muscle cells were observed by fluorescent inverted microscope.By using the mixture of recombinant expression plasmidin several immune dose and pIRES - ORF81 injected Carp′s intramuscular and immunized once a week, three times in total. Blood was sampling before injection and serum was collected to detect antibody levels by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Two weeks after the third immunization,experiment result showed that antibody titer reach the highest level. Compared with pIRES - ORF81alone immune,antibody level of combined immunization increased obviously, but no significant difference was observed between them(P>0.05). Show that carp Ⅰ - IFN -γ have certain immune effectas koi herpesvirus immune adjuvant.

Ⅰ-IFN-γ; koi herpesvirus; nucleic acid vaccine pIRES- ORF81; immune effect

公益性行业专项-锦鲤疱疹病毒病核酸疫苗的研制及初步应用(106037-2016-2018)；国家现代农业产业体系项目(CARS-46-29)

于慧，硕士研究生，从事病毒分子学方面研究。

周井祥,E-mail:zhjxnd@126.com;刘艳辉，E-mail:liuyanhui9@163.com

2016-07-04

A

1002-1280 (2016) 08-0009-07

S852.6