猪弓形虫和附红细胞体双重PCR检测方法的建立及应用

于新友，李天芝，张 颖，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪弓形虫和附红细胞体双重PCR检测方法的建立及应用

于新友1，李天芝1，张 颖2，李 峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

根椐GenBank中登录的猪弓形虫和附红细胞体核苷酸序列，分别设计2对引物，在建立各病原单项PCR技术的基础上，优化双重PCR反应条件，建立了2种病原的双重PCR检测方法，用这2对引物对同一样品中的弓形虫和附红细胞体核酸模板进行双重PCR扩增，结果可同时扩增弓形虫的241 bp，附红细胞体的748 bp的特异性片段，而对其它5份猪病原及对照的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该双重PCR技术能检出0.1 pg的弓形虫和0.1 pg的附红细胞体模板。用72份临床病料对此研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证，结果显示，两者总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点，可用于对这两种病原的同时检测和鉴别诊断。

猪弓形虫；附红细胞体；双重PCR；检测

弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病[1]。猪对弓形虫尤其易感，死亡率可高达60%以上[2]。临床症状主要为呼吸困难，呈犬坐呼吸，耳尖、鼻端、四肢内侧、腹下出现紫红色斑块，怀孕母猪表现为流产、死胎或产弱胎等。附红细胞体病是附红细胞体（Eperythrozoon suis, E.suis）寄生于多种动物和人红细胞表面及血浆、骨髓内而引起的一种人兽共患病[3]。1932年Doyle首次报道了猪附红细胞体病，并将其病原归类立克次氏体[4]，后根据其16S rRNA基因序列与血巴通氏体有很近的亲缘关系而将其划为柔膜体纲支原体属[5]。猪附红细胞体病在我国猪群中广泛存在，不同品种和日龄的猪均易感染，其中以哺乳仔猪和怀孕母猪受到的危害最严重[6]，临床表现主要为贫血、黄疸、高热、血尿，母猪不发情、不孕、流产、死胎等繁殖障碍性等，严重者可导致猪只死亡。由于猪弓形虫和附红细胞体病都是人兽共患病，因此，防治这两种病具有重要的公共卫生意义。临床上二者常呈混合感染，给养猪业造成了严重的损失。目前，对这两种病均没有效的疫苗和药物进行预防，因此，快速、准确的诊断这两种疾病，从而采取有效的防控措施非常有必要，对这两种病原传统的病原学及血清学检测方法存在费时费力、检出率不高、假阳性多等各种弊端。PCR检测方法检测速度快、敏感性高、特异性好，目前已经广泛应用于各种疾病的诊断。已有很多采用PCR方法对这两种病进行检测的报道，但都是对单一病原的检测。笔者根据弓形虫SAG1和附红细胞体16S rRNA保守基因序列设计引物，优化了反应条件，建立一种可用于上述两种病原的双重PCR诊断方法，并对临床病料进行检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病原

猪弓形虫、附红细胞体、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、猪链球菌2型、巴氏杆菌和健康猪抗凝血由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存。临床检测样品为2016年3—8月采自鲁北地区猪场猪抗凝血。

1.2 工具酶及试剂盒

pMD18-T载体、Premix Tag、DL 2 000 Marker购自大连宝生物公司，多功能DNA纯化回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司产品，裂解液由本实验室自己配制。

1.3 引物的设计与合成

参考GenBank中登录的弓形虫（DQ104423）和附红细胞体（JQ710901）基因序列，利用 Primer Premier 5.0软件设计2对特异性引物（表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用灭菌水溶解并配成15 pmol/mL溶液备用。

表1 附红细胞体和弓形虫基因扩增引物

1.4 病原基因组的提取

参照文献[7]提取病原基因组DNA，具体方法如下：取纯化的弓形虫或附红细胞体悬液100 μL加入1.5 mL离心管中，加入1 mL裂解液 [100 mmol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、pH 7.5 20 mmol/L三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）、2%十二烷基磺酸钠（SDS）]，在液氮和56℃水浴中反复冻融3次，加入5～6 μL（20 mg/mL）蛋白酶K，使其终浓度为100 μg/mL。混匀后在56℃水浴2 h。用酚∶氯仿∶异戊醇（24∶25∶1）进行抽提两次，12 000 r/min离心10 min。将上面的水相小心吸取到灭菌的EP管中。在水相中加入3 M醋酸钠（pH 5.2）60～70 μL，再加入2倍体积的冷乙醇在-20℃冰箱中沉淀1 h。将沉淀完全的样品在4℃冷冻离心机中12 000 r/min离心30 min，弃上清后再用75%酒精洗涤一遍。弃酒精后晾干，用TE缓冲液或是灭菌四蒸水溶解，-20℃保存，备用。并提取其它几种病原的核酸。

1.5 反应条件优化

最适退火温度的确定：分别以46、48、50、52、54、56、58℃的退火温度进行梯度PCR反应，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度。

最适引物浓度的确立：在25 μL PCR反应体系中分别以0.2、0.3、0.4、0.6、0.8和1.0 pmol/μL的引物浓度进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳引物浓度，筛选出双重PCR反应体系的最佳反应模式。

1.6 特异性试验

用已建立的双重PCR扩增，分别对猪弓形虫、附红细胞体、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、猪链球菌2型、巴氏杆菌和健康猪抗凝血的模板进行扩增，扩增反应同时设双蒸水阴性对照，扩增反应结束后进行凝胶电泳检测，以检验双重PCR的特异性。

1.7 双重PCR的敏感性试验

分别提取弓形虫和附红细胞体的DNA，用仪器测定含量，并依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取1 μL为模板，采用已优化的双重PCR反应条件分别对上述不同稀释度的DNA进行双重PCR扩增，反应结束后进行凝胶电泳检测，以检测建立的双重PCR的敏感性。

1.8 重复性试验

用建立的双重PCR检测方法分别对弓形虫感染的8份阳性样品、附红细胞体感染的6份阳性样品及5份阴性样品，分别重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.9 临床样品的检测

对采自滨州、德州、东营、淄博等鲁北地区猪场的72份抗凝血样品进行双重PCR检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件BLAST进行序列分析。

2 结果与分析

2.1 反应条件的优化

通过对猪弓形虫和附红细胞体双重PCR引物浓度及扩增温度、时间和循环次数等的优化，最后确定双重PCR中最佳引物浓度分别为弓形虫引物0.4pmol/μL、附红细胞体引物0.6 pmol/μL。双重PCR的最佳反应模式为：94℃ 5 min，94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。

2.2 扩增产物的检测

将弓形虫和附红细胞体的核酸分别进行双重PCR扩增，结果能扩增出与预期相符，弓形虫的241 bp，附红细胞体的748 bp的特异性片段，而对照扩增不出任何条带，其扩增产物的电泳结果见图1。

图1 单项PCR扩增结果

2.3 特异性试验

采用建立的双重PCR方法对猪弓形虫、附红细胞体、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、猪链球菌2型、巴氏杆菌、健康猪抗凝血和水对照在相同的条件进行扩增。结果显示，弓形虫和附红细胞体的PCR产物的片段长度分别为241 bp和748 bp，与预期大小一致，而猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、猪链球菌2型、巴氏杆菌、健康猪抗凝血和水对照均未扩增出片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图2，说明本研究建立的双重PCR方法特异性强。

图2 特异性试验

2.4 敏感性试验

提取弓形虫和附红细胞体基因组DNA，用仪器测定含量，然后做10倍梯度稀释，每个稀释度取1 μL作为模板。结果显示，用0.1 pg的弓形虫和0.1 pg的附红细胞体仍然可以扩增出特异性条带（图3），表明该双重PCR敏感性强。

图3 敏感性试验

2.5 重复性试验

经过3次重复操作，结果一致，表明本研究建立的双重PCR方法是稳定可靠的。

2.6 临床样品的检测

对72份在不同地区采集的抗凝血样品，用建立的双重PCR和单项PCR进行检测，两者符合率达100%（表2），且测序结果与预期一致，表明建立的双重PCR检测体系的特异性和敏感性较好。

本文研究结果显示,实施优质护理服务模式的观察组患者的骨折愈合时间显著短于实施常规护理的对照组,关节功能恢复情况也显著优于对照组,观察组的护理满意度显著优于对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。该研究结果与相关文献[5]报道相符。综上所述,应用优质护理服务模式对骨折患者进行护理干预,促进骨折愈合,能够显著提高患者的骨折恢复优良率,值得临床上广泛应用。

表2 被检病料单项PCR与双重PCR检测对比试验结果

3 讨论

猪弓形虫病特异PCR诊断的遗传标记主要有B1基因、ITS序列、529 bp重复序列、致密颗粒蛋白、SAG1基因等，SAG1是弓形虫的主要表面抗原基因，表达的约占虫体蛋白总量的3%～5%，能被弓形虫感染急性期或恢复期血清抗体识别，是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原。猪附红细胞体16S rRNA基因高度保守，可作为检测的靶基因。

王海燕等[8]根据弓形虫B1基因设计引物，建立诊断弓形虫病特异性的PCR方法，结果显示，该法最低能检测到10个弓形虫速殖子DNA，且与寄生于猪体内的6种常见微生物无交叉反应。闫若潜等[9]以猪弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区（ITS1）序列为模板设计引物，建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法，该法可从基因组DNA中扩增出273 bp的目的DNA片段，特异性好，敏感性高，最低能检测到的弓形虫DNA量为0.001 ng，且与相关的9种对照寄生虫、细菌和病毒无交叉反应。张浩吉等[10]根据猪附红细胞体16S rRNA基因设计引物，建立了猪附红细胞体PCR检测方法。该法对其它7种病原的基因组DNA没有扩增带出现，对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为160pg。张影等[11]根据GenBank上发表的猪附红细胞体DnaJ基因序列设计引物，建立了猪附红细胞体PCR诊断方法，结果显示，该法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段，最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL。

临床上猪弓形虫病、附红细胞体病常和其它病原如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪链球菌2型、猪巴氏杆菌等混合感染，使患猪死亡率增加，且这些混合感染的病原引起的临床症状类似，因此必须借助实验室诊断才可以确诊。此外，许多猪群感染猪弓形虫或附红细胞体后可以不表现明显临床症状而处于潜伏感染状态，但一旦外界环境改变或患其它疾病或机体的抵抗力降低时，则会引发这两种疾病。因此建立弓形虫病原的检测方法对于该病的早期诊断、检测、防治及猪群的净化非常必要。对猪弓形虫和猪附红细胞体传统检测方法都有不足之处，病原学诊断涂片检测仅适合于弓形虫病急性暴发性病例的死后诊断，而对慢性感染或经药物治疗后的猪意义不大，容易造成漏检。血清学诊断不能判断现症感染，对临床病例确诊没有太大意义，PCR检测适合弓形虫现症感染的诊断。猪附红细胞体血液涂片染色镜检常常受到血液里不明微生物、染料颗粒和非病原性物质等因素的干扰，血清学方法存在抗原纯度低、来源不足等缺点，因此，PCR是检测这两种病原的最佳方法。

在双重PCR反应中，引物的设计很重要，对双重PCR反应是否成功起着决定性的作用。本研究分别针对弓形虫SAG1和附红细胞体16S rRNA保守基因序列设计引物，优化了双重PCR扩增反应条件，确定了双重PCR中弓形虫和附红细胞体最佳引物浓度和最佳退火温度，方法特异性好，检测灵敏度高。临床应用检测结果显示，72份抗凝血样品中检测的猪弓形虫的阳性率为18.1%，猪附红细胞体的阳性率为66.7%，二者混合感染样品4份，混合感染率为5.6%，双重PCR方法与单项PCR检测结果符合率为100%。与单项PCR检测相比可节省50%的时间和1/2的试剂用量，减少了污染环境的机会，对临床上猪弓形虫病和附红细胞体病的检测具有较好的应用价值。

[1]赵蕾，于新友，王金良，等.弓形虫病疫苗研究进展[J].中国兽药杂志，2011，45（6）：48-52.

[2]闫若潜，刘光辉，赵雪丽，等.猪弓形虫特异性PCR诊断方法的建立及应用[J].中国动物检疫，2007，24（3）：28-31.

[3]孙刚，孙光，郭昭林.动物附红细胞体病[J].黑龙江畜牧兽医，2003（12）：72-73.

[4]Heinritzi K.Eperythrozoon infection in swine as a disease factor[J].Berl Munch Tierarztl Wochenschr,1989,102(10)：337-342.

[5]Wu J,Yu J,Song C,et al.Porcine eperythrozoonosis in China[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,2006，1081：280-285.

[6]Hoelzle L E.Haemotrophic mycoplasmas:Recent Advances in Mycoplasma suis[J].Vet Microbiol,2008，130(3-4)：215-226.

[7]于新友.微小隐孢子虫病毒转染载体的构建及GFP在其体内的表达[D].长春：吉林大学，2007.

[8]王海燕，马广鹏，任庆娥，等.猪弓形虫病PCR诊断方法的建立[J].河南农业大学学报，2008，42（5）：524-527.

[9]闫若潜，刘光辉，赵雪丽，等.猪弓形虫特异性PCR诊断方法的建立及应用[J].中国动物检疫，2007，24（3）：28-31.

[10]张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用[J].中国兽医学报，2005，25（5）：480-483.

[11]张影，贾立军，薛书江，等.猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用[J].中国兽医杂志，2013，49（1）：24-27.

（编辑：郭玉翠）

城市嘈杂易致记忆力丧失

【《印度时报》网站11月12日报道】题：研究发现生活在繁忙、吵闹的城市会导致人记忆力丧失

有时，记忆随着年龄丧失是正常现象，这是衰老的迹象。但经常性丧失记忆，比如忘记每天的任务或想不起某人的名字，则可能预示着一个严重得多的问题。

土耳其阿吉巴代姆医院神经科医生内尔吉兹·许塞伊诺说，记忆丧失与生活在大城市压力大有明显关系。

苏格兰研究人员将这种状况称为繁忙生活方式综合征（BLS），其症状包括沮丧、压力大、注意力无法集中。

在阿尔茨海默病或帕金森病患者中常见记忆丧失现象，但环境因素使这一现象在年轻人中也越来越常见。

许塞伊诺说：“如果出现了一些令人担心的迹象，比如遇到熟人时认不出来，或者反复问同样的问题，那就要咨询神经科医生了。”

尽管女性的记忆力好于男性，但女性若感到沮丧也会导致忘事。

许塞伊诺总结道：“恰当的睡眠习惯、不吸烟、经常服用维生素是防止记忆丧失的有效手段。”

（转自参考消息[N]，2016-11-17）

Establishment and Application of a Duplex PCR Assay for Detection of Toxoplasma Gondii and Eperythrozoon Suis

YU Xinyou1,LI Tianzhi1,ZHANG Ying2,LI Feng2,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Lvdu Bio-Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China; 2.Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

To identify and differentiate rapidly the cause of clinical diseases.A duplex polymerase chain reaction was optimized to simultaneously detect two pathogens ofToxoplasma gondii (T.gondii)and Eperythrozoon suis(E.suis)in this article.Two sets of specific primers were designed according to the sequences of T.gondii and E.suis at the GenBank.By using two pairs of virus specific primers,two PCR assay were established to amplify the conservative regions of the two viruses,respectively.Consequently,a duplex PCR method to detect the two viruses in one tube was developed.The duplex PCR system would amplify a 241 bp for T.gondii and 748 bp fragment for E.suis imultaneously or separately in the samples,depending on its infection status.But not specific band amplified from other seven pig pathogeny and control article.As little as 0.1 pg of T.gondii and 0.1 pg of E.suis DNA were detected using gel electrophoresis in the duplex PCR.To evaluate the duplex PCR,72 clinical samples were comparatively detected.The data showed that the duplex PCR method being 100%coincidence with the single PCR,and it can be used for this two pathogeny detection and differential diagnosis.

Toxoplasma gondii;Eperythrozoon suis;duplex PCR;detection

S858.28

A

1002-1957(2016)06-0121-04

2016-09-05

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）

于新友（1983-），男，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事猪病诊断技术研究工作.E-mail：yuxinyou.2006@126.com