川崎病患儿T细胞免疫功能的变化及临床意义

游文忠，周发为,卢巧，黄华

(湖北民族学院附属民大医院,1.小儿内科;2.检验科，湖北 恩施 445000)



川崎病患儿T细胞免疫功能的变化及临床意义

游文忠1，周发为2,卢巧1，黄华1

(湖北民族学院附属民大医院,1.小儿内科;2.检验科，湖北 恩施 445000)

目的：观察川崎病(kawasaki disease，KD)患儿体内T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的变化，分析其在KD发病中的意义。方法：选取KD患儿55例设为KD组，同期住院的普通发热非KD患儿47例设为非KD组，另选取同期门诊体检的健康儿童40例设为对照组。使用流式细胞仪检测各组儿童外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+比例，分析ROC曲线特征。使用ELISA法检测各组儿童血清白介素6(IL-6)、IL-1β及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果：KD急性期患儿组外周血CD3+、CD3+CD8+、CD4+CD25+比例低于非KD组及对照组；CD3+CD4+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+比例高于另两组(P<0.01)。KD组患儿血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显高于非KD组及对照组(P<0.01)，非KD组IL-1β及IL-6水平高于对照组(P<0.01)。KD患儿CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+ROC曲线对KD的诊断界值分别为54.5%、28.6%、20.4%、26.1%、1.8%、6.0%。结论：KD患儿体内存在T淋巴细胞亚群失衡，表现为CD4+CD25+、CD3+CD8+减少，CD3+CD4+、CD3+CD19+比例及CD4+/CD8+比值升高，且IL-6、TNF-α、IL-1β等细胞因子水平升高，可能参与了KD病理过程。

川崎病;儿童;T淋巴细胞;细胞因子;免疫功能;诊断界值

川崎病(kawasaki disease，KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征(MCLS)，是临床较为常见的血管炎性综合征，发病机制至今不明，多发于5岁以下婴幼儿且发病率逐年增加。临床以持续性发热、球结膜充血、口唇病变、皮疹、颈淋巴结肿大为主要表现，若治疗不及时，易引起小儿后天性心脏病，严重影响患儿的健康发育及生活质量[1]。KD的诊断缺乏特异性实验室指标，仅凭早期临床表现难以确诊，且该病不典型病例发生率高达10%～20%。研究表明遗传易感性、微生物感染、血管基质的代谢紊乱、T细胞介导的免疫应答失调等因素在KD发病中具有重要作用[2]，其中免疫学异常在该病发病中具有十分重要的作用[3-4]。本研究检测了KD患儿体内T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的变化，分析其在KD发病中的意义，为该疾病的早期诊断提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2015年9月于湖北民族学院附属民大医院小儿内科住院治疗的KD患儿55例设为KD组，均符合2005年版《实用儿科学》制定的诊断标准[5]。其中男性37例，女性28例；年龄6个月～7岁，平均(2.9±0.7)岁；病程5～10 d，平均(6.2±1.5)d。入组标准：①发热5 d以上；②手足症状：末端梭形肿胀，热退脱皮；③皮肤多形红斑；④粘膜改变：口腔粘膜牛肉色，球结膜充血；⑤口唇干裂、杨梅舌；⑥非化脓性颈部淋巴结炎。排除入组前使用免疫功能调节药物患儿、合并其他免疫系统疾病患儿。选取同时期住院的普通发热、淋巴结肿大非KD患儿47例设为非KD组，男性27例，女性20例，年龄6个月～6岁，平均(2.7±0.7)岁；病程1～6 d，平均(3.5±1.2)d。另选取同期门诊体检的健康儿童40例设为对照组，男性26例，女性14例；年龄6个月～6岁，平均(2.8±0.6)岁。3组婴幼儿年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 流式细胞术检测方法

3组儿童入院后采集静脉血5 mL置于肝素抗凝管内，-70 ℃保存以备检测。每份标本分别取抗凝血100 μL，加FITC标记的CD4单克隆抗体、PE标记的CD8单克隆抗体、ProcP标记的CD3+单克隆抗体(均购自美国赛默飞世尔公司)各20 μL，室温避光孵育15～20 min。4 ℃ 0.01 mol/L的PBS洗涤二次，加1%多聚甲醛0.5 mL，使用Epics XL-MCL流式细胞仪(美国贝克曼公司)，激发光波长488 nm。每份样本获取细胞数10 000个，计算阳性细胞的百分数，以相应血液标本做各自同型阴性对照。

1.3 ELISA检测方法

每份标本分别取抗凝血清100 μL，使用ELISA法检测血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平，严格按照说明书操作。

1.4 观察指标

观察KD组患儿、非KD组患儿，及对照组儿童外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+水平，以及IL-6、TNF-α及IL-1β水平，同时分析KD患儿外周血淋巴细胞亚群ROC曲线特征。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 3组儿童外周血各淋巴细胞比较

KD急性期患儿组外周血CD3+、CD3+CD8+、CD4+CD25+比例低于非KD组及对照组；CD3+CD4+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+比例显著高于后两组儿童，差异均有统计学意义(P<0.01)。非KD组患儿与对照组儿童淋巴细胞差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组外周血淋巴细胞亚群比较±s)

*P<0.01，与非KD组比较； #P<0.01，与对照组比较。

2.2 KD患儿外周血淋巴细胞亚群ROC曲线特征分析

KD患儿CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+亚细胞群对KD的诊断界值分别为54.5%、28.6%、20.4%、26.1%、1.8%、6.0%，相应特征见表3。

表2 KD患儿外周血淋巴细胞亚群ROC曲线特征(%)

2.3 3组儿童血清细胞因子水平比较

KD组患儿血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显高于非KD组及对照组(P<0.01)，非KD组IL-1β及IL-6水平高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表3 3组儿童血清细胞因子水平比较±s，pg/mL)

*P<0.01，与非KD组比较； #P<0.01，与对照组比较。

3 讨论

KD是一种病因不明、急性自限性血管炎性综合征，主要临床表现为发热、颈淋巴结肿大、一过性皮疹、球结膜充血等，若未经及时治疗，可并发冠脉损伤、心肌梗死，甚至心源性猝死，是引发儿童后天获得性心脏病的原因之一[6-7]。

临床研究表明KD患儿体内存在免疫系统过度激活，T淋巴细胞亚群失衡，即抑制性/细胞毒性T淋巴细胞群(CD4+CD25+、CD3+CD8+)减少，辅助性/诱导性T淋巴细胞群(CD3+CD4+、CD3+CD19+)数目增加，CD4+/CD8+比值升高[8-9]。过度活化的CD4+细胞分泌大量细胞因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子等，可能是引起本病急性发热反应的原因[10-11]。CD4+CD25+调节性T细胞数目减少，对T淋巴细胞及B淋巴细胞的抑制作用减弱，导致机体抗体分泌增加。本研究结果显示KD组患儿体内存在免疫异常活化，且CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的敏感度、特异度相对较高，其诊断界值与KD的诊断结果具有较高符合度，与郭晓军等[12]研究一致，表明淋巴细胞亚群含量检测及ROC曲线特征可作为KD简便的实验室指标，有助于KD早期诊断。

研究[13]发现，KD患儿急性期血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高，这可能与冠状动脉血管炎、脑部血管炎症等，以及深层次的免疫损伤机制相关。本研究发现KD组患儿上述3项指标均明显增高。有助于KD的临床诊断。而韩云坤等[14]研究发现KD急性期患儿的IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高，而在亚急性期有所下降，但IL-6水平仍高于对照组，TNF-α、IL-1β与热性对照组间无显著性差异，表明KD亚急性期炎症因子水平检测对疾病诊断的假阳性可能性较大，在细胞因子检测方面不及淋巴细胞亚群检测结果可信度高。

综上所述，KD患儿体内存在T淋巴细胞亚群失衡及炎症介质异常，可能参与了KD病理进程。KD患儿外周血淋巴细胞亚群及细胞因子检测，有助于早期诊断KD患儿，评价疾病状态，指导治疗。

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[13]Abe J.Cytokines in Kawasaki disease[J].Nippon Rinsho,2014,72(9):1548-1553.

[14]韩云坤,孙冰,李丽红,等.川崎病T细胞免疫及细胞因子变化的研究[J].中国实验诊断学,2011,15(9):1533-1536.

(学术编辑：皮光环)

Changes of T cell immune function and the clinical significance in infants with kawasaki disease

YOU Wen-zhong1,ZHOU Fa-wei2,LU Qiao1,HUANG Hua1

(1.InternalMedicineDepartmentofPediatrics;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,MindaHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,Hubei,China)

Objective：To observe the changes of T lymphocyte subsets and relative cytokines in infants with kawasaki disease (KD) and to observe their significance in process of KD.Methods：A total of 55 infants with KD were selected as KD group,while 47 infants with non-KD in corresponding period served as non-KD group,and another 40 healthy infants undergoing physical examinations as control group.Flow cytometer (FCM) was used to detect the ratios of peripheral blood CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3+CD19+,CD4+/CD8+ and CD4+CD25+ in all groups and analyze the curve characters of receiver operating characteristic (ROC).Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied to detect the levels of serum interleukin 6 (IL-6),IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in all groups.Results：KD group was evidently lower in the ratios of peripheral blood CD3+,CD3+CD8+ and CD4+CD25+,but markedly higher in the ratios of CD3+CD4+,CD3+CD19+ and CD4+/CD8+ than other two groups (P<0.01).KD group was notably higher in levels of serum TNF-α,IL-1β and IL-6 than other two groups (P<0.01),whereas non-KD groups was significantly higher in levels of IL-1β and IL-6 than control group (P<0.01).The diagnostic critical values of ROC curves of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3+CD19+,CD4+/CD8+ and CD4+CD25+ were 54.5%,28.6%,20.4%,26.1%,1.8% and 6.0% respectively.Conclusion：Infants with KD have imbalance of T lymphocyte subsets marked by reduced CD4+CD25+ and CD3+CD8+,increased ratios of CD3+CD4+,CD3+CD19+ and CD4+/CD8+ as well as levels of IL-6,TNF-α and IL-1β,which may participate in the pathological process of KD.

Kawasaki disease;Children;T lymphocyte;Cytokine;Immune function;Diagnostic critical value

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.031

2016-06-22

游文忠(1964-)，男，主任医师。

黄华，E-mail：hhyjxx@sohu.com

时间：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.062.html

1005-3697(2016)06-0888-03

R725.4

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