HPLC法测定枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量

孟文静，苑青艳，吴金梅，汪德刚*

(1.林州中农颖泰生物肽有限公司，河南 林州，456550；2.河南牧业经济学院， 郑州，450011)

HPLC法测定枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量

孟文静1，苑青艳1，吴金梅2，汪德刚2*

(1.林州中农颖泰生物肽有限公司，河南 林州，456550；2.河南牧业经济学院， 郑州，450011)

为了建立枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量的高效液相色谱(HPLC)测定方法，选用色谱柱Agilent Ecilpse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.1%氨水(70∶30)磷酸调pH=8.0，流速为0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃。齐墩果酸和熊果酸能达到基线分离，分离度R>2.5，齐墩果酸在0.20～7.94 μg、熊果酸在0.21～8.49 μg范围内呈良好的线性关系。试验证明该方法操作简单，灵敏度高，重现性好，可用于枇杷叶药材的质量控制。

枇杷叶；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱法

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eiobotryajaponica(Thunb．)lindl. 的干燥叶，我国大部分地区均有栽培，主要分布于中南地区及陕西、安徽、甘肃、浙江、江苏、江西、福建、四川、贵州、云南、台湾等省区。全年均可采收，晒干，刷去毛，切丝，干燥，生用或蜜炙用。枇杷叶始载于《名医别录》，列为中品。其味苦，微寒，归肺、胃经。具有清肺止咳，和胃降逆之功效。主要用于治疗肺热咳喘痰稠；胃热烦渴，呕哕。枇杷叶的化学成分主要包括三萜酸类，如熊果酸、齐墩果酸、乌苏酸等；挥发油类，新鲜叶含挥发油0.045%～0.108%，油中主成分为橙花椒醇(Nerolidol)、金合欢醇(Farnesol)、α、β-蒎烯等；黄酮类；糖苷类；以及皂苷、鞣质及维生素B1等，枇杷叶具有止咳[1]、抗炎[2]、降血糖[3]、降脂[4]、护肝[5]等药理活性。其中三萜酸类在枇杷叶中含量高，药理药效研究也主要集中在三萜酸类，2010版《中国兽药典》[6]将枇杷叶三萜酸类中的齐墩果酸和熊果酸的总含量作为质量标准。齐墩果酸和熊果酸常用的检测方法为高效液相色谱法，参照相关文献进行了大量试验验证，发现目前的检测方法存在分离度低、响应值小、基线平稳性差等方面的问题。由此，经过不断摸索改进流动相的组成和比例，采用HPLC法建立了枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。

1 仪器与试剂

美国Waters e2695高效液相色谱仪；美国Waters 2489紫外检测器；紫外分光光度计，美国PerkinElmer公司，型号LAMBDA 35；KQ3200E型超声波清洗器；齐墩果酸对照品(供含量测定用，国家药品标准物质，110709～201206)；熊果酸对照品(供含量测定用，国家药品标准物质，110742～201421)；枇杷叶药材(购自河南禹州药材市场)；乙腈和甲醇均为色谱纯(德国默克Merck)，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 检测波长选择 用甲醇将齐墩果酸、熊果酸和两种三萜酸的混合标准品稀释至一定浓度，作为对照品溶液，用纯甲醇作空白对照，采用紫外分光光度计在200～400 nm对对照品进行全扫描，齐墩果酸、熊果酸和两种三萜酸的混合标准品分别在210.39、211.85、210.50 nm波长下有最大吸收，所以将210 nm定为最大吸收波长。

2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent Ecilpse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%氨水(70∶30)磷酸调pH=8.0，流速为0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃。

2.3 对照品溶液及样品制备

2.3.1 对照品溶液配制 精密称量10 mg齐墩果酸(含量为94.9%)和10 mg熊果酸(含量为93.8%)，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，分别制成1 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 取枇杷叶粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声萃取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm的微孔滤膜，即得[6]。进样量为20 μL。

齐墩果酸保留时间19 min，理论塔板数14000；熊果酸保留时间20 min，理论塔板数15900，两种成分的分离度为2.57，大于标准要求的1.5，达到了完全分离。

对照品及样品的HPLC色谱图见图1。

a：齐墩果酸和熊果酸对照品；b：枇杷叶药材图1 齐墩果酸和熊果酸对照品及枇杷叶药材色谱图

2.4 标准曲线制备 分别精密吸取上述两种对照品溶液10、25、50、100、200、400 μL置1 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成不同浓度的混标。进样量20 μL，按上述色谱条件上机测定，以峰面积为纵坐标，以齐墩果酸和熊果酸的浓度为横坐标，经线性回归处理，得到齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别为：Y=17356X-42797(r=0.99992)；Y=12368X-32442(r=0.99991)，结果表明，齐墩果酸在0.20～7.94 μg、熊果酸在0.21～8.49 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验 精密吸取上述两种对照品溶液各0.2 mL，置于1 mL容量瓶，制成混标。精密吸取混标20 μL，在上述色谱条件下重复进样5次，按照上述色谱条件测定峰面积。齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.4%、0.5%。结果显示，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样，每次进样量20 μL，按上述色谱条件测定峰面积。齐墩果酸RSD=0.7%，熊果酸RSD=0.8%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 称取枇杷叶药材1 g，共6份，按照制备供试品溶液制备方法制备供试品，按照色谱条件测定峰面积，齐墩果酸RSD=0.26%，熊果酸RSD=0.15%，结果表明方法重现性良好，

2.8 回收率试验 精密称取已知含量的枇杷叶药材，共6份，精密加入齐墩果酸对照品和熊果酸对照品溶液，按2.3.2项下的制备方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，按照色谱条件测定峰面积，并计算加样回收率。齐墩果酸RSD=1.72%，熊果酸RSD=1.86%，结果表明方法回收率良好，见表1。

表1 枇杷叶药材齐墩果酸和熊果酸回收率试验结果

2.9 耐用性试验 耐用性试验是指测定条件在有小的变动情况下，测定结果不受影响的承受程度。在对柱温(±5℃)、流速(±20%)、流动相比例(±5%)、流动相pH(±0.5)、检测波长(±2 nm)和色谱柱的改变进行了考察，结果显示色谱条件小幅度的改变对色谱峰的分离度、峰面积影响皆符合要求，仅部分条件下的保留时间发生了变化,见表2。

表2 耐用性试验结果

3 讨论与小结

3.1 色谱条件考察 齐墩果酸和熊果酸为枇杷叶中含量较高的两种三萜酸类成分，因为两种成分为结构相似，性质相近的同分异构体，并且在植物中常以结合或游离的形式同时存在，所以分离存在一定的难度。齐墩果酸和熊果酸的最大吸收波长均为210 nm，属于末端吸收，测定时易有干扰物质，两种物质出峰时间也相差很短，药典规定完全分开的两个峰的分离度需大于1.5，因此选取适宜的流动相种类和比例非常重要。

在水相的选择上，试验参照国内相关文献、《中国兽药典》和《中国药典》[7]中对枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的高效液相检测方法，采用不同比例、不同浓度的乙酸铵[8-9]、磷酸[10-12]、冰醋酸[13]、磷酸盐缓冲液[14]等试剂及其组合体系作为水相进行考察，发现乙酸铵溶液作为水相虽可以改变峰形，提高分离度(R>1.5)，但由于乙酸铵在210 nm处存在紫外吸收，导致基线呈波浪状，影响主成分检测结果的准确性。采用磷酸或冰乙酸溶液作为水相时，基线较平，但分离度低(R=1.2)。

在有机相的选择上，采用乙腈作为有机相时，基线较为平稳，且响应高，峰形尖锐对称，单独采用甲醇或甲醇、乙腈按一定比例混合作为有机相时，出峰慢且响应低，因此乙腈较适合作为两物质检测的有机相。

在流动相pH值的选择上，研究发现文献中齐墩果酸和熊果酸高效液相检测方法所采用的流动相多为酸性，其pH值在2～6之间，酸性环境并不有利于齐墩果酸和熊果酸的分离，而在碱性条件下，两种物质呈离子状态，分离效果好，所以试验采用浓度为0.1%的氨水作为水相，通过磷酸调节pH值至8.0，以延长所用色谱柱的寿命，在此前提下选择洗脱效果较强的乙腈作为有机相，不断调整有机相和水相的比例，使枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的分离度达到规定要求。最终色谱条件确定以乙腈-0.1%氨水(70∶30)磷酸调pH=8.0作为流动相，采用Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流速为0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃。可以在25 min内有效分离齐墩果酸和熊果酸，齐墩果酸和熊果酸的分离度达到2.5以上，并且基线平稳，峰形较佳。

3.2 前处理条件考察 在对枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的前处理方法选择上，主要对提取溶剂和提取方法进行了研究。采用了不同浓度的甲醇、乙醇作为提取溶剂，分别采用超声和加热回流两种方法处理，通过含量测定进行比较，最终选择100%的甲醇超声1 h为前处理条件。由于色谱图前端色素峰响应值很高，导致后端的齐墩果酸和熊果酸峰相对偏低，因此考察了甲醇提取前采用石油醚超声除杂对色谱的影响，结果发现经石油醚除杂后的色谱与未除杂色谱并无明显差异，故而可以省去此步骤。

采用本方法检测枇杷叶药材中的齐墩果酸和熊果酸含量，操作简单，方法稳定，灵敏度高，结果准确。可以为枇杷叶药材及其相关制剂质量控制提供科学依据。

[1] 葛金芳,李俊,金涌,等.枇杷叶三萜酸的镇咳祛痰平喘作用[J].安徽医科大学学报,2006,41(4):413-416.

[2] 葛金芳,李俊,姚宏伟,等.枇杷叶三萜酸的抗炎作用[J].安徽医科大学学报, 2007, 42(2):174-178,214.

[3] 谢筱琳,钟颖. 枇杷叶乙醇提取物降血糖的实验研究[J].中医药导报, 2009, 15(5): 93-94.

[4] 蔺美玲,陈红梅,张小郁,等.齐墩果酸抑制高脂饮食肥胖大鼠体重的实验研究[J].成都医学院学报, 2010, 5(1):16-20.

[5] 邱林立,罗德生,许娟,等.乌索酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].咸宁医学院学报, 2009, 23(2):97-99.

[6] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2010年版[S].

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版[S].

[8] 郭娜,徐榕青,林文津,等.不同来源枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量比较研究[J]. 中国民族民间医药, 2013, 22(22):5-6.

[9] 陈珏蓓,马文彪,王月红.HPLC法测定枇杷止咳胶囊中齐墩果酸与熊果酸的含量[J].青海医药杂志,2012,42(3):79-81.

[10]秦雯,张兰珍,石任兵.不同产地夏枯草中熊果酸和齐墩果酸的含量比较[J].北京中医药大学学报,2011,34(7):478-481.

[11]黄林杰,韦韬,林冬杰,等.山楂含片中熊果酸的含量测定[J].医学信息,2014,(34):345-346.

[12]霍文兰,范小芹,赵天聪.超声法提取山楂果中熊果酸和齐墩果酸的工艺研究[J].应用化工，2013,42(10):1832-1835.

[13]徐天玲,倪开勤.高效液相色谱法测定肝肾康胶囊中熊果酸的含量[J].湖北中医药大学学报,2012,14(1):31-32.

[14]李蕾蕾,黄洁燕,王海霞,等.气候及地理环境对枇杷叶质量的影响初探[J].中国药业,2013,22(22):48-50.

(编辑：陈希)

Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Loquat Leaf by HPLC

MENG Wen-jing1,YUAN Qing-yan1,WU Jin-mei2,WANG De-gang2*

( 1.linzhouSinagriYingtaiBiotechCo.ltd,Henan,linzhou456550,China;2.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450011,China)

To establish an HPLC method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in loquat leaf. HPLC was carried out on Agilent Ecilpse plus C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm) at 30 ℃ using acetonitile-0.1%ammonium water (70∶30, phosphoric acid pH to 8.0) as mobile phase with a flow rate of 0.8 mL/min and the UV detection wavelength was set at 210 nm. Oleanolic acid and ursolic acid can reach the baseline separation, degree of separation(R) was more than 2.5. Oleanolic acid was linear in the range of 0.20～7.94 μg. Ursolic acid was linear in the range of 0.21～8.49 μg. The method is simple, convenient, accurate, and can be used for the quality control of loquat leaf．

loquat leaf; oleanolic acid; ursolic acid; HPLC

孟文静，硕士，从事中兽药新制剂方面研究。

2016-08-11

A

1002-1280 (2016) 10-0036-04

S853.72