乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的生物学活性分析

张海月，康元环，孙武文，陈龙，张冬星，安鼎杰，田佳鑫，单晓枫，钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的生物学活性分析

张海月，康元环，孙武文，陈龙，张冬星，安鼎杰，田佳鑫，单晓枫*，钱爱东*

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

为研究维氏气单胞菌胞外产物在乌鳢感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理，以乌鳢源维氏气单胞菌WL161为研究对象，提取其胞外产物，采用打孔法测定其胞外产物的酶活性，并对与毒力密切相关的溶血活性进行进一步的溶血谱研究，同时分析其致病性。应用LC-MSMS方法对其胞外产物蛋白成分进行鉴定，利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明，WL161菌株具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明胶酶活性；ECP对其他多种动物红细胞均有溶血活性，对鱼类红细胞溶血性较强，但对鸡红细胞无溶血活性。其胞外产物共检测出118种蛋白，共参与40种生物学过程，主要涉及碳水化合物代谢过程、几丁质分解代谢过程、DNA结合等；69种分子功能主要涉及ATP结合、金属离子结合、碳水化合物结合等；19种细胞组分主要包括胞外区、细胞质、细胞外膜等。

维氏气单胞菌；胞外产物；酶活；GO分类分析

维氏气单胞菌是一种人兽鱼共患病原菌[1]，该菌对多种不良环境具有耐受能力，可在4 ℃条件下缓慢生长并产生毒力因子[2-3]，其毒力有强弱之分，强毒菌株可能感染宿主使之发病，或者通过一定的传播途径感染其他动物，患病动物以出血性败血症和肠炎等为主要临床表征[4]。胞外产物(ECP)是致病菌在生长繁殖过程中释放出的代谢产物，是侵染机体的主要成分之一[5]。ECP可以抵抗宿主免疫因子的作用，分解破坏宿主机体的组织成分，有利于其他病原的进一步侵染；还可以破坏机体血淋巴中凝血系统的酶活性，破坏血细胞，并导致溶血现象的发生等等，因此ECP成为决定病原菌毒力的重要因素之一[6]。目前国内外对维氏气单胞菌胞外产物的研究鲜有报道。本试验以乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物为研究材料，对其主要蛋白酶活性、致病性及蛋白成分进行分析。

1 材料与方法

1.1 菌种 乌鳢源维氏气单胞菌WL161，由本实验室分离鉴定[7]并保存。

1.2 试验动物 试验用斑马鱼购自长春市某花鸟鱼市场，体重0.3～0.4 g，体长3.0～3.5 cm，暂养观察2周无异常后进行试验，试验前禁食24 h。

1.3 维氏气单胞菌胞外产物(ECP)的制备 在无菌条件下，用铂耳在TSA平板上挑取单菌落接种于不含酚红的DMEM培养基，28 ℃ 180 r/min振荡培养36 h后收集培养物，4 ℃，12000 r/min离心30 min，收集上清液。经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，加入固体硫酸铵至75%的饱和度，4 ℃静置过夜。4 ℃，12000 r/min 离心30 min，弃上清液，用0.02 mol/L Tris-HC1 (pH 7.4)缓冲液将沉淀重悬，经透析，聚乙二醇(PEG)10000浓缩，得到胞外产物，然后涂于TSA固体平板，确定无菌后分装，-20 ℃保存备用。1.4 胞外产物的酶活性及溶血性分析 用打孔法测定维氏气单胞菌ECP的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、明胶酶酶活性以及溶血活性。分别配置含可溶性淀粉(2%)、吐温80 (1%)、脱脂牛奶 (8%)、明胶(4%)和兔鲜血(7%)的TSA平板。用直径为6 mm打孔器在平板上打孔并用酒精灯火焰稍微加热封底。向孔内加入50 μL胞外产物以50 μL TSA液体培养基为阴性对照，30 ℃培养24～48 h后观察结果。

1.5 胞外产物溶血谱测定 参照Sahu I等[8]的方法略有改进，测定胞外产物对鲫鱼、草鱼、鲤鱼、鲢鱼、鸡、兔、小白鼠等动物红细胞的溶血价。胞外产物用无菌生理盐水在96孔板上倍比稀释，然后加入等量的2%红细胞，轻轻混匀，37 ℃温箱放置1 h，然后4 ℃冰箱过夜，以50%的红细胞溶解的ECP最高稀释度为溶血价。设2个对照组，对照组A为不加任何物质的红细胞稀释液，对照组B为100%溶血的红细胞悬液。1.6 胞外产物致病性的测定 将200尾健康斑马鱼随机分成4组，试验Ⅰ组将维氏气单胞菌离心取沉淀，并用PBS反复洗涤3次，以去除ECP，并用无菌PBS十倍递进稀释至2.8×108、2.8×107、2.8×106、2.8×105、2.8×104、2.8×103CFU/mL，每个浓度注射10尾；试验Ⅱ组注射维氏气单胞菌胞外产物，ECP浓度为0.48 mg/mL，用无菌PBS倍比稀释至0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 mg/mL，每个浓度注射10尾；试验Ⅲ组注射处理后的维氏气单胞菌菌体与胞外产物的混合物，具体情况见表2；对照组20尾注射无菌PBS，每尾斑马鱼腹腔注射10 μL。感染后观察7 d，统计死亡数量。

1.7 胞外产物蛋白成分鉴定及GO功能分析 纯化WL161胞外产物，采用液相色谱与串联质谱相结合的方法(LC-MSMS)对胞外产物蛋白成分进行鉴定。通过Blast检索序列相似的模式生物蛋白，对鉴定到的蛋白进行GO功能分析(生物学过程、分子功能和细胞组分)，信息来自 UNIPROT (http://www.uniprot.org)网站。

2 结果与分析

2.1 胞外产物的酶活性及溶血性 维氏气单胞菌WL161的胞外产物在各平板上30 ℃培养24～48 h后观察发现，淀粉平板加入卢戈氏碘液后加样孔周围出现透明环；吐温80平板加样孔周围出现了不透明的白色晕圈；脱脂牛奶平板加样孔周围出现了透明环；兔血培养基平板加样孔周围出现了无色透明环；明胶酶培养基平板加样孔周围无变化(图1)。结果表明，维氏气单胞菌WL161株胞外产物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明胶酶活性。

A.淀粉酶;B.脂肪酶;C.蛋白酶;D.溶血活性;E.明胶酶图1 WL161胞外产物的酶活性

2.2 胞外产物溶血谱测定结果 WL161胞外产物对鲤鱼的溶血价最高为26；其次为鲫鱼和鲢鱼25；

乌鳢和草鱼溶血价均为24；对兔和小白鼠溶血价分别为23、22；对鸡红细胞无溶血作用(表1)。

表1 维氏气单胞菌胞外产物溶血谱

注：-为无溶血活性

2.3 致病性 健康斑马鱼攻毒后都有不同程度的死亡现象产生，试验Ⅲ组注射处理后维氏气单胞菌菌体与胞外产物混合物具有较强的致病性，2.8×107CFU/mL的菌液混有0.24 mg/mL胞外产物时死亡率达到100%，且攻毒后3 h即发生死亡，12 h时已死亡70%；试验Ⅱ组注射维氏气单胞菌胞外产物，浓度0.48 mg/mL时死亡率为100%，攻毒后6 h即发生死亡；试验Ⅰ组注射处理后维氏气单胞菌菌体，攻菌浓度为2.8×108CFU/mL时全部死亡；PBS对照组均未死亡(表2)。

2.4 质谱鉴定与蛋白功能分析 运用LC-MSMS方法分析维氏气单胞菌WL161胞外产物，共检测出118种蛋白，其中有27种为功能未知蛋白，43种假定蛋白，其余蛋白分别为蛋白酶S8、外膜血红素受体、麦芽糖孔蛋白、菌毛蛋白、鞭毛钩蛋白FlgE、分泌蛋白等等。其中具有丝氨酸内肽酶活性的蛋白酶S8为可信度最高蛋白，其次为具有受体活性和转运活性的外膜血红素受体和具有相同功能的一种假定蛋白，可信度同样较高的蛋白还有：位于胞外区参与几丁质分解代谢过程和碳水化合物代谢过程的几丁质酶、胞外区的气溶素、具有膜孔蛋白活性的外膜蛋白Aha1等。

表2 WL161菌株及其胞外产物致病性分析结果

续表

根据所鉴定蛋白的GO注释信息，对其进行GO分类：其中参与生物学过程的蛋白有40种，这些生物学过程主要包括碳水化合物代谢过程、几丁质分解代谢过程和DNA结合等；参与分子功能的蛋白共有69种，其中具有ATP结合、金属离子结合、碳水化合物结合功能的蛋白较多；参与细胞组分的蛋白共有19种，这些蛋白主要位于胞外区、细胞质、细胞外膜等。

3 讨论与小结

本试验对乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的酶活性进行了初步分析。与目前已报道的维氏气单胞菌胞外产物酶活性存在差异[7-9]，具体原因可能与分离鱼的种类、菌株致病性不同等有关。由于淀粉酶具有分解糖原的作用，脂肪酶分解脂类，蛋白酶能分解胶原等蛋白成分，溶血活性导致各组织出现溶血现象。所以当维氏气单胞菌感染乌鳢时，分泌的ECP的酶活性与溶血活性致使乌鳢的肌肉组织、结缔组织、上皮组织等溶解，从而为细菌提供了营养物质。随着时间的延长，细菌增殖，胞外产物中的酶量也随即增多，对乌鳢皮肤、肌肉的破坏程度也不断增加，从而引起乌鳢出血和溃疡。

维氏气单胞菌胞外产物能溶解多种动物的红细胞，但对不同动物的红细胞的敏感性存在差异。胞外产物对红细胞的溶血作用与动物种类有很大关系，不同动物溶血价不同。本试验中胞外产物对鱼类红细胞的溶血价比其它动物要高。邬向东[10]等发现鳝鱼源嗜水气单胞菌胞外产物、杨贺[9]等发现斑点鮰源维氏气单胞菌胞外产物对鱼类红细胞溶血价比对其他动物高，与本试验结果相似。

通过对致病性的分析发现，菌体与胞外产物混合感染斑马鱼时，短时间内即发生死亡，同等浓度时毒力较单独攻菌体或胞外产物有所增强；单独感染胞外产物即可导致斑马鱼的发病和死亡，死亡率也较高，且致病性较单独感染菌体稍强；感染维氏气单胞菌菌体时，死亡数量开始较少，随着时间的延长，死亡数量逐渐增多，呈递增趋势，究其原因，该组注射的病原菌不含有ECP，对鱼的致死性依赖于细菌在体内的增值。

经过GO分类分析发现，蛋白具有较为广泛的生物学功能覆盖范围，从生物学过程中可以看出胞外产物参与调控的蛋白多是参与能量代谢相关途径，如碳水化合物代谢、几丁质分解代谢等。细胞组分分析发现这些蛋白更多定位于生命活动的主要场所细胞质、胞外区和细胞外膜。分子功能分析表明这些蛋白的功能集中在ATP结合、金属离子结合、碳水化合物结合及水解酶活性等。

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(编辑：侯向辉)

Bioactivity Analysis of Extracellular Products ofAeromonasveroniiStrain Isolated from Channa Argus
ZHANG Hai-yue，KANG Yuan-huan，SUN Wu-wen，CHEN Long，ZHANG Dong-xing，
AN Ding-jie，TIAN Jia-xin，SHAN Xiao-feng*，QIAN Ai-dong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to study the pathogenic role of extracellular products(ECP) and pathogenic mechanism ofAeromonasveronii，this study extracted the extracellular products fromAeromonasveroniiWL161.The enzyme activity and hemolytic activity of extracellular products were determined by punch method.LC-MSMS and Gene Ontology method were used to identify the protein components of the extracellular products and analysed biological process,molecular function and cellular components,respectively.The results showed that WL161 had amylase and lipase activity, protease and hemolytic activity,without gelatinase activity.ECP of most animals have a hemolytic activity, and the hemolytic effect of ECP showed a high hemolytic activity to fish erythrocyte, while no hemolytic activity to chicken erythrocyte.118 kinds of proteins were detected by the extracellular products.These proteins involved in 40 kinds of biological processes,especially carbohydrate metabolism process,chitin catabolic process and DNA binding;69 kinds of molecular functions,mainly involved ATP binding,metal ion binding,carbohydrate binding;19 kinds of celelular components, including extracellular region,cytoplasm and cell outer membrane.

Aeromonasveronii; extracellular products; enzyme activity; GO classification analysis

国家自然科学基金项目(31201927)；吉林省重点科技攻关项目(20150204065NY)

2016-08-29

A

1002-1280 (2016) 10-0006-04

S852.61