PRRSV体外感染PAMs对IFN-γ mRNA转录水平的影响

闫晓霞，刘欢欢，曾梦颖，高洪，严玉霖

(云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201)

PRRSV体外感染PAMs对IFN-γ mRNA转录水平的影响

闫晓霞，刘欢欢，曾梦颖，高洪，严玉霖*

(云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201)

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对IFN-γ mRNA转录水平的影响,选用PRRSV血清抗体和抗原均为阴性的4周龄健康仔猪3头，无菌分离PAMs，随机将其分为对照组、PRRSV感染组(PRRSV组)、PRRSV+PHA组和RRRSV+Dex组，分别在培养6、12、24、48和60 h收集PAMs。运用荧光定量PCR检测IFN-γ和PRRSV mRNA转录情况。结果显示，PRRSV mRNA转录量在感染PAMs后6～24 h逐渐升高，在48 h有所下调，在60 h再次升高，IFN-γ mRNA转录量在6～48 h逐渐升高，24、48 h显著高于对照组，而到60 h又恢复到对照组水平；与同时间点的PRRSV组相比，PRRSV+PHA组中PRRSV mRNA转录量有所下调，IFN-γ mRNA转录量有所上调；而RRRSV+Dex组PRRSV mRNA转录量有所上调，IFN-γ mRNA转录量所下调。结果表明，IFN-γ 在一定程度上可以抑制PRRSV在PAMs中的增殖，IFN-γ的抑制可能是PRRSV导致细胞损伤的机制之一。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；肺泡巨噬细胞；干扰素-γ

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是一种有囊膜的不分节段的单股正链RNA病毒[1-2]。根据基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(LV株为代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株为代表株)[3]。PRRSV主要侵害肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAMs)，从而导致弥散性间质性肺炎，损害机体免疫机能，进一步对机体造成继发性感染[4]，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失[5]。干扰素(interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子,主要由活化的T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞产生，可诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，促进抗病毒免疫[6-7]。 国内外对PRRSV感染PAMs的研究主要局限在I型干扰素。鉴于此，本研究运用实时荧光定量PCR技术，对PRRSV 感染PAMs不同时期IFN-γmRNA转录水平的变化进行检测，从而了解IFN-γ与PRRSV 抗感染之间的关系，为PRRSV的防控提供参考依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 PRRSV云南株YN-2011(登录号：JX857698)由本实验室分离纯化保存，其TCID50为1 mL 105.06。

1.1.2 实验动物 经ELISA 和RT-PCR方法检测PRRSV血清抗体和抗原均为阴性的4周龄健康仔猪3头。

1.1.3 主要仪器与试剂 XDS-2倒置显微镜购自重庆光电仪器总公司；CO2培养箱购自美国Thermo scientific公司；BIO-RAD-CFX荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；PRRSV抗体ELISA检测试剂盒购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；PHA-L购自美国Sigma公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser、SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程( 大连) 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺泡巨噬细胞的制备 将试验猪置于无菌室解剖台上，颈静脉放血致死，剖开胸腔，结扎气管后连同心脏取出完整的肺，用0.01 g/L pH 7.4的PBS充分漂洗肺表面，清除血块，从气管往肺注入0.01 g/L pH 7.4的PBS 50～100 mL,轻轻拍打肺表面1～2 min后回收灌洗液，用单层无菌过滤筛过滤，收集全部灌洗液，1500 r/min离心5 min，最后用含有双抗的 PBS洗涤PAMs两次，1500 r/min离心5 min，即为所得PAM。RPMI-1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞浓度为2×106mL-1，以每孔2 mL铺在6孔细胞板于37 ℃、 5% CO2培养箱培养2 h，当PAMs贴壁后，弃上清,待用。

1.2.2 试验分组与处理 将生长在6 孔板上的PAMs 细胞分为4 组。正常对照组；PRRSV感染组；PRRSV+PHA组：在经过PRRSV感染后的PAMs中加入5 μg/mL的PHA-L进行处理[8]；RRRSV+Dex组：在经过PRRSV感染后的PAMs中加入0.1 mg/mL的Dex进行处理[9]。每组设3个重复。各组加入的病毒量为100 μL，对照组接种等体积的细胞培养液，分别于感染后6、12、24、48和60 h收集PAMs，-80 ℃保存，用于荧光定量PCR检测。

1.2.3 荧光定量PCR检测PRRSV和IFN-γ mRNA转录水平 使用Trizol提取总RNA，应用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒逆转录总RNA成为cDNA，于-20 ℃保存。Realtime-PCR反应体系: SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)12.5 μL， 上、下游引物(表1)各1.0 μL，cDNA 2 μL，dH20 8.5 μL。按以下程序进行Realtime-PCR反应：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，Tm 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环。每个样本设置3个重复孔。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.2.4 IFN-γ与PRRSV mRNA转录水平相关性分析 根据各试验组各时间点IFN-γ与PRRSV mRNA相对转录量，以PRRSV mRNA转录水平为纵坐标，IFN-γ mRNA转录水平为横坐标，做转录水平相关性分析。

2 结果与分析

2.1 细胞中IFN-γ mRNA转录 根据不同时间点Ct值，用2-△△Ct计算不同组IFN-γ mRNA相对转录量。IFN-γ mRNA在各组不同时间点的转录水平如图1。PRRSV组中，IFN-γ mRNA转录量在6～48 h逐渐升高，6 h显著低于对照组(P<0.01)，24和48 h显著高于对照组(P<0.01)，而到60 h又恢复到对照组水平；PRRSV+PHA组IFN-γ mRNA转录水平显著高于对照组及PRRSV组；RRRSV+Dex组IFN-γ mRNA转录水平在6、12、24和60 h显著低于对照组和PRRSV组(P<0.01或P<0.05)。

图1 IFN-γ mRNA在各组不同时间点的转录水平(*P<0.05，**P<0.01)

图2 PRRSV mRNA在各组不同时间点的转录水平(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 细胞中PRRSV mRNA转录 根据不同时间点Ct值，用2-△△Ct计算不同组PRRSV mRNA相对转录量。由图2可以看出，PRRSV组PRRSV mRNA转录量在感染后6～24 h逐渐升高，48 h有所下调，60 h再次升高；PRRSV+PHA组PRRSV mRNA的转录量与相同时间点PRRSV组中PRRSV mRNA的转录量相比显著下调(P<0.01或P<0.05)；RRRSV+Dex组PRRSV mRNA的转录量与相同时间点PRRSV感染组相比有所上调，在12、24 h差异显著(P<0.01或P<0.05)。

2.3 IFN-γ与PRRSV mRNA转录水平相关性分析 不同试验组之间IFN-γ与PRRSV mRNA相关性分析见图3。根据|R|∈[0.1,0.3)为弱相关，|R|∈[0.3,0.5)为中等相关，|R|∈[0.5,1.0]为强相关得出：PRRSV感染组R2=0.01728，R=0.13，弱相关；PRRSV+PHA组R2=0.0176，R=0.13，弱相关；RRRSV+Dex组R2=0.086，R=0.29，弱相关。

图3 不同实验组 IFN-γ与PRRSV转录水平相关性分析

3 讨论与小结

IFN-γ主要是由抗原、有丝分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T细胞及NK细胞所分泌的一类可溶性糖蛋白，有较强的抗病毒活性和免疫调节作用，如诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、星状细胞等MHCⅡ类抗原的表达，使其参与抗原递呈和特异性免疫的识别过程，促进巨噬细胞 FcγR 表达，协同诱导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors, TNF )并促进巨噬细胞杀伤病原微生物[10]。抗原、T细胞促分裂素(PHA)、细胞因子(IL-2、IL-12、IL-18)会诱导IFN-γ的合成，地塞米松、糖皮质激素、IL-10对INF-γ的产生具有抑制作用[11]。因此选取PHA作为阳性对照，地塞米松作为阴性对照。本研究应用q-PCR技术对不同组中IFN-γ的mRNA转录水平进行分析，结果发现PRRSV组中，IFN-γ mRNA转录量在6～48 h逐渐升高，说明PRRSV可以刺激PAMs分泌IFN-γ。而6 、12 h低于对照组，说明该时期可能处于病毒感染的初期，刺激PAMs分泌IFN-γ的能力较弱，而到了60 h又恢复到对照组水平是因为病毒在PAMs中的增殖，大量的PAMs已脱落、凋亡。以上结果与夏九鲜等人的研究结果相类似[12]。而PRRSV+PHA组和RRRSV+Dex组IFN-γ mRNA转录水平分别高于和低于同时间点的PRRSV组，这一结果与T细胞促分裂素(PHA)会诱导IFN-γ的合成，地塞米松对INF-γ的产生具有抑制作用的研究相符[11]。

已有研究表明IFN-γ可以抑制PRRSV 在体外培养的细胞中增殖。本研究应用q-PCR技术对不同组中PRRSV的mRNA转录水平进行检测，结果发现PRRSV+PHA组PRRSV mRNA的转录量与相同时间点PRRSV组中PRRSV mRNA的转录量相比显著下调，这一结果与利用IL-12处理PAMs刺激其分泌IFN-γ最终可以降低PRRSV在PAMs中的增殖的结果相类似[8]。RRRSV+Dex组PRRSV mRNA的转录量与相同时间点PRRSV感染组相比有所上调，这与佟杰[13]等研究地塞米松可以加强PRRSV在体内的复制，从而使病毒感染造成的损伤加重的结果相类似。另外，本研究结果显示PRRSV组IFN-γ mRNA转录水平与PRRSV转录水平存在弱负相关关系，表明PRRSV在PAMs细胞内的增殖复制抑制了IFN-γ的产生，这也是PRRSV导致机体免疫抑制的机制之一。

研究结果对于临床用药具有一定的指导意义，结果表明PRRSV感染后可用PHA等药物或促进剂刺激干扰素的产生，对PRRSV的复制增殖具有一定的抑制作用，这与临床中用干扰素治疗PRRSV猪只的研究类似[14]；DEX是糖皮质激素类药物，虽具有抗炎、抗过敏和抗毒作用，但本研究结果显示DEX抑制IFN-γ的产生，从而促进了PRRSV的增殖复制，因此PRRSV感染后不建议使用DEX，这与佟杰等[13]连续7 d低剂量注射DEX会造成仔猪机体免疫抑制，增加其死亡率的结果一致。

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(编辑：侯向辉)

The Effects of PRRSV Infected PAMs on Transcription Levels of IFN-γinVitro

YAN Xiao-xia, LIU Huan-huan, ZENG Meng-ying, GAO Hong, YAN Yu-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming, 650201,China)

To explore the effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infected pulmonary alveolar macrophage (PAMs) on transcription levels of IFN-γinvitro，three four weeks old piglet free of PRRSV was used in this experiment. The PAMs were isolated aseptically and divided into control group, PRRSV infection group (PRRSV group),PRRSV+PHA group，PRRSV+Dex group and culturedinvitro. The PAMs were collected at 6, 12, 24, 48 and 60 hours post infection. The mRNA transcription of IFN-γ and PRRSV were analyzed by Real-Time PCR. The results shows that the mRNA levels of PRRSV in PRRSV group were gradually increased at 6～24 h and were decreased at 48 h ; the transcription of IFN-γ were gradually increased at 6～48 and significantly higher at 24 and 48 h than control group. PRRSV+PHA group the mRNA levels of PRRSV were slightly lower and the IFN-γ is higher than PRRSV group; RRRSV+Dex group the mRNA transcription of PRRSV were higher but the IFN-γ is lower.The results indicated IFN-γ can inhibit the proliferation of PRRSV in PAMs，the inhibition of IFN -γ is probably one of the mechanisms that PRRSV cause cellular damage.

PRRSV；PAMs；IFN-γ

2016-07-07

A

1002-1280 (2016) 10-0001-05

S852.65

国家自然科学基金项目(31160496，31360599)；云南农业大学2015年研究生科技创新项目(2015ykc4)