CD31分子在T淋巴细胞表面的表达频率和慢性HBV感染关系的初步研究

俞立飞 卢丹 张永乐 张忠东 潘熠健 吕铁锋

310006杭州市第一人民医院（俞立飞）；430300武汉市黄陂区人民医院（卢丹）；310012杭州，浙江省立同德医院（张永乐）；310023杭州市西溪医院（张忠东、潘熠健、吕铁锋）

·论著·

CD31分子在T淋巴细胞表面的表达频率和慢性HBV感染关系的初步研究

俞立飞 卢丹 张永乐 张忠东 潘熠健 吕铁锋

310006杭州市第一人民医院（俞立飞）；430300武汉市黄陂区人民医院（卢丹）；310012杭州，浙江省立同德医院（张永乐）；310023杭州市西溪医院（张忠东、潘熠健、吕铁锋）

目的研究慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者外周血CD31分子在T淋巴细胞表面的表达频率与血清ALT水平、HBeAg、HBV DNA之间的关系，初步探讨CD31分子表达频率与慢性HBV感染之间的关系，了解CHB患者的免疫状态变化。方法收集42例未进行抗病毒治疗的CHB患者和25例健康体检者的新鲜全血，常规分离淋巴细胞，应用流式细胞仪检测外周血CD4＋、CD8＋、CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋、CD31＋CD8＋／CD8＋细胞的百分比，同时采用全自动生化分析仪测定血清ALT水平、实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量、化学发光法检测HBV血清标志物。结果CHB患者外周血CD4＋、CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞百分比显著低于健康体检者，差异具有统计学意义（t＝2.293、2.183、2.765、2.200，P值均＜0.05）；CHB患者中ALT＜2ULN组CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞百分比显著低于ALT≥2ULN组，差异具有统计学意义（t＝2.150、2.377、2.937、3.128，P值均＜0.05）；HBVDNA低载量组（＞103⁃105拷贝／mL）、中载量组（＞105⁃107拷贝／mL）和高载量组HBV DNA（＞107⁃109拷贝／ml）CD31分子表达频率呈上升趋势，但组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；HBeAg阴性组CD31＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞百分比显著低于HBeAg阳性组，差异具有统计学意义（t＝2.284、2.128、2.631，P值均＜0.05）。结论CHB患者T淋巴细胞表面CD31表达频率下降；CHB患者T淋巴细胞表面CD31分子表达频率与血清ALT水平、HBVDNA的不同载量、HBeAg存在一定的关系；慢性HBV感染者的免疫状态可能与T淋巴细胞表面CD31分子表达频率有关。

Fund program：Hangzhou Health and Key Specialty Scientific Research Projects（20130733Q31）

CD31分子，又名血小板内皮细胞黏附分子⁃1（PECAM⁃1），是一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，在血管内皮细胞上高表达，有报道称血小板、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞和NK细胞表面均有CD31分子表达［1］。近年来，CD31分子在炎症和细胞免疫中的作用越来越受到研究者的重视［2，3］，但是它在慢性HBV感染中作用的报道较少。本研究通过检测42例未行抗病毒治疗的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者外周血CD31分子在T淋巴细胞表面的表达频率，观察其与血清ALT水平、HBVDNA载量、HBeAg之间的关系，初步探讨CD31分子表达频率与慢性HBV感染之间的关系，了解CHB患者的免疫状态变化。

1 材料及方法

1.1 研究对象本研究入选2012年1月⁃2013年1月在浙江中医药大学附属杭州市西溪医院住院以及门诊病历资料完整的42例CHB患者，其中男性31例，女性11例，年龄19⁃60岁，平均（35.4± 11.5）岁；HBeAg阳性22例，HBeAg阴性20例，ALT中位数103 U ／L，HBVDNA均值（6.14±1.76）log10IU／mL，对照组为25例健康体检者，其中男性19例，女性6例，年龄21⁃62岁，平均年龄（34.4±8.8）岁，两组在性别（χ2＝0.040，P＝0.842）、年龄（t＝－0.325，P＝0.762）上无统计学差异。

CHB患者诊断符合2010版中华医学会肝病学会、感染病学会分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》［4］。所有病例入选前半年内未使用过抗病毒药物及糖皮质激素等影响免疫功能的药物，所有入组者排除合并甲、丙、丁、戊、庚型肝炎，HIV、梅毒等感染性疾病；排除脂肪肝、血吸虫病、药物性肝炎、自身免疫性肝病或其它免疫相关性疾病；排除严重心、脑、肾、肿瘤等疾病；排除妊娠或哺乳期妇女。

1.2 标本采集入组者新鲜EDTA抗凝静脉全血，常规分离淋巴细胞，4 h 内上机检测。

1.3 主要仪器及试剂FC 500 MCL／MPL流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）、雅培Architect i2000SR全自动免疫分析仪（美国雅培公司）、7900HT荧光定量PCR检测仪（美国ABI公司）、7600⁃020E日立全自动生化分析仪（日本Hitachi公司）；anti⁃human CD4⁃FITC／CD8⁃PE、anti⁃human CD31⁃APC、同型对照anti⁃mouseIgG1K⁃APC均购自美国eBioscience公司；TQ⁃prep处理剂，即A、B、C液三种液体（本实验室自制）；HBV血清标记物酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海科华生物股份有限公司）；ALT检测试剂盒（日本和光生物科技股份有限公司）；HBV DNA实时荧光定量PCR法检测试剂盒（上海之江基因股份有限公司）。

1.4 流式细胞仪检测外周血CD31在T淋巴细胞表面的表达频率CD31⁃APC荧光标记标本上机，使用CXP系统软件（美国Beckman Coulter公司）设定检测淋巴细胞数量＞2000个，高速，对检测标本进行设门，检测外周血CD4＋、CD8＋、CD31＋、CD4＋CD31＋、CD8＋CD31＋、CD4＋CD31＋／CD4＋、CD8＋CD31＋／CD8＋细胞表面分子百分比。

1.5 统计学方法用SPSS Statistics 16.0软件进行统计学处理，实验所得计量资料以（±s）表示，用独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB患者和健康体检者外周血T淋巴细胞亚群的百分比42例CHB组外周血CD4＋、CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞表面分子百分比显著低于25例健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而两组间CD8＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD8＋／CD8＋细胞表面分子百分比无统计学差异（P＞0.05）（见表1）。

表1 CHB患者和健康体检者外周血T淋巴细胞亚群的百分比（%，±s）Tab.1 The percentage of peripheral blood T lymphocyte subgroup in patients with CHB and healthy control

表1 CHB患者和健康体检者外周血T淋巴细胞亚群的百分比（%，±s）Tab.1 The percentage of peripheral blood T lymphocyte subgroup in patients with CHB and healthy control

组别GroupCD4＋CD8＋CD31＋CD31＋CD4＋CD31＋CD8＋CD31＋CD4＋／CD4＋CD31＋CD8＋／CD8＋CHB组（n＝42）CHB group（n＝42）39.3±6.926.4±4.543.1±10.09.7±4.716.1±6.124.7±9.561.1±16.8健康对照组（n＝25）Healthy control group（n＝25）43.3±7.328.4±3.749.0±8.113.2±5.618.6±6.530.5±11.765.6±10.7 t 2.2931.8892.1832.7651.3452.2001.363 P 0.0250.0630.0330.0070.1830.0310.186

表2 不同ALT水平CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率（%，±s）Tab.2 The frequency of CD31 molecule expression on the surface of peripheral blood T lymphocyte in the patients with different ALT level

表2 不同ALT水平CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率（%，±s）Tab.2 The frequency of CD31 molecule expression on the surface of peripheral blood T lymphocyte in the patients with different ALT level

组别GroupCD31＋CD31＋CD4＋CD31＋CD8＋CD31＋CD4＋／CD4＋CD31＋CD8＋／CD8＋≥2ULN组（n＝23）≥2ULN group（n＝23）46.7±10.311.2±4.918.8±6.128.5±10.263.9±19.6＜2ULN组（n＝19）＜2ULN group（n＝19）39.9±9.98.1±2.913.9±4.120.5±5.257.5±15.2 t 2.1502.3772.9373.1281.274 P 0.0380.0220.0050.0030.210

表3 不同HBVDNA载量CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率（%，±s）Tab.3 The frequency of CD31 molecule expression on the surface of peripheral blood T lymphocyte in the patients with different loads of HBVDNA

表3 不同HBVDNA载量CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率（%，±s）Tab.3 The frequency of CD31 molecule expression on the surface of peripheral blood T lymphocyte in the patients with different loads of HBVDNA

组别GroupCD31＋CD31＋CD4＋CD31＋CD8＋CD31＋CD4＋／CD4＋CD31＋CD8＋／CD8＋低载量组（n＝11）Lower group（n＝11）38.2±10.77.9±2.813.5±4.620.5±5.655.6±13.9中载量组（n＝11）Middle group（n＝11）42.8±10.69.5±3.415.8±4.524.1±7.860.1±24.0高载量组（n＝20）Higher group（n＝20）47.6±10.511.4±6.318.6±7.527.2±13.461.9±13.9 F 2.3891.7712.3771.3770.399 P 0.1080.1860.1090.2670.674

2.2 外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率与ALT水平的关系根据抗病毒的一般适应症［4］将CHB患者血清ALT水平分为ALT≥2ULN组23例及ALT＜2ULN组包括ALT水平正常患者19例进行比较，ALT＜2ULN组CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞表面分子百分比显著低于ALT≥2ULN组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而两组间CD31＋CD8＋／CD8＋细胞表面分子百分比无统计学差异（P＞0.05）（见表2）。

2.3 外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率与HBVDNA载量的关系本实验中所有CHB患者的HBV DNA＞103拷贝／mL，根据HBV DNA载量不同分组［5］，将其分为低载量组（＞103⁃105拷贝／ml）11例、中载量组（＞105⁃107拷贝／ml）11例和高载量组HBVDNA（＞107⁃109拷贝／ml）20例，三组比较CD31分子表达频率随着HBV DNA载量的升高呈上升趋势，但组间各细胞表面分子百分比两两比较无统计学差异（P＞0.05）（见表3）。

2.4 外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率与HBeAg的关系42例CHB患者分为HBeAg阳性组22例和HBeAg阴性组20例，HBeAg阴性组CD31＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞表面分子百分比显著低于HBeAg阳性组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而CD31＋CD4＋、CD31＋CD8＋／CD8＋细胞表面分子百分比在两组间无统计学差异（P＜0.05）（见表4）。

表4 HBeAg阳性和阴性CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率（%，±s）Tab.4 The frequency of CD31 molecule expression on the surface of peripheral blood T lymphocyte in the patients with HBeAg positive or negative

表4 HBeAg阳性和阴性CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率（%，±s）Tab.4 The frequency of CD31 molecule expression on the surface of peripheral blood T lymphocyte in the patients with HBeAg positive or negative

组别GroupCD31＋CD31＋CD4＋CD31＋CD8＋CD31＋CD4＋／CD4＋CD31＋CD8＋／CD8＋HBeAg阳性组（n＝22）HBeAg⁃positive group（n＝22）47.0±10.310.9±5.118.3±6.2127.5±10.665.0±12.1 HBeAg阴性组（n＝20）HBeAg⁃negative group（n＝20）39.9±9.88.6±2.814.7±4.621.0±8.957.4±10.8 t 2.2841.8452.1282.6311.677 P 0.0280.0720.040.0120.103

3 讨论

慢性HBV感染与机体的免疫状态密切相关，尤其是T细胞免疫，T细胞的数量及功能紊乱在HBV感染慢性化中发挥了重要作用。本研究中慢性HBV感染患者CD4＋T细胞百分比显著低于正常人，虽然CD8＋T细胞百分率与正常人无统计学差异，但也有所下降，这与王慧等人的研究结果一致，提示由于T细胞免疫功能下降，机体不能有效清除HBV，致使HBV持续感染［6，7］。

CD31分子是一类抑制性调节分子。文献报道［8，9］慢性HBV感染患者免疫耐受形成的机制可能与Treg细胞数量及功能有关，而Treg细胞表面表达CD31分子频率与其抑制功能呈正相关。本实验通过检测CHB患者中外周血T淋巴细胞中表达CD31分子百分比，发现CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子的表达频率降低，CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD4＋／CD4＋细胞表面分子的百分比显著低于健康对照组，说明CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子的低表达可能与T细胞免疫水平密切相关。本研究中，CHB患者外周血T淋巴细胞表面CD31分子表达频率在ALT≥2ULN组较ALT＜2ULN组高，HBV DNA载量低组较HBV DNA载量高组低，而HBeAg阴性组较HBeAg阳性组低，表明CD31分子的表达频率与血清ALT水平、HBVDNA不同载量及血清HBeAg状态存在一定的关系，可能与CHB的免疫耐受与免疫再活动有关。

HBeAg阴性的CHB多出现在免疫再活动期，发生HBeAg向抗⁃HBe血清转化之后，表现为ALT不同水平升高、较低水平的HBV复制、肝脏持续性炎症活动，且大多数患者存在不同程度的肝纤维化。推测HBeAg阴性的CHB的发生可能与T淋巴细胞表面CD31分子表达频率下降有关。本研究观察到CHB患者的CD31＋CD8＋／CD8＋细胞表面分子百分比与健康人无明显差异，未发现其与血清ALT水平、HBV DNA不同载量及血清HBeAg有关系，这可能是由于CD31分子在CD8＋T淋巴细胞亚群表达高于其它T淋巴细胞亚群，它表达频率的变化不能及时显现出来。关于CD31分子在CD8＋T细胞上的功能及变化趋势，有待于后续进行深入研究。

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［2］ Kusumbe AP，Ramasamy SK，Itkin T，et al.Age⁃dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells［J］. Nature，2016，532（7599）：380⁃384.doi：10.1038／nature 17638.

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［6］ 王慰，任桂芳，刘玉珍，等.慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的变化［J］.实用肝脏病杂志，2012，15（4）：346⁃347.doi：10.3969／j.issn.1672⁃5069.2012.04.024.

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A preliminary study about the relationship between the frequency expression of CD31 molecule on T lymphocytes surface and chronic HBV infection

Yu Lifei，Lu Dan，Zhang Yongle，Zhang Zhongdong，Pan Yijian，Lyu Tiefeng

Hangzhou First People’s Hospital，Hangzhou 310006，China（Yu LF）；Wuhan Huangpi District People′s Hospital，Wuhan 430300，China（Lu D）；Tongde Hospital Of Zhejiang Province，Hangzhou 310012，China（Zhang YL）；Hangzhou Xixi Hospital，Hangzhou 310023，China（Zhang ZD，Pan YJ，Lv TF）

Lv Tiefeng，Email：tiefenglv＠126.com；Yu Lifei，Email：yulifei1981＠sina.com

ObjectiveTo investigate the level of CD31 molecule expression on peripheral T lymphocytes of patients with chronic hepatitis B（CHB），and to study the relationship between the expression of CD31 molecule and serum ALT levels，serum levels of HBV DNA and HBeAg.Preliminarily explore the relationship between the expression frequency of CD31 molecule and patients CHB，in order to understand changes in different immune status when chronic HBV infecting.MethodsA total of non⁃antiretroviral therapy 42 patients with CHB and 25 healthy volunteers were enrolled for the study.In peripheral blood，separated lymphocytes conventionally，the percentage of CD4＋、CD8＋、CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋、CD31＋CD8＋／CD8＋cells were assessed by flow cytometry，serum ALT levels were tested by automatic biochemical analyzer，serum HBVDNA levels weredetermined by real⁃time fluorescent quantitative PCR，and the serological markers of HBV were examined through chemiluminescence simultaneously.ResultsThe percentages of CD4＋、CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD4＋／CD4＋cells in patients with CHB were significantly less than the healthy（P＜0.05）；the percentages of CD31＋、CD31＋CD4＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋cells in ALT＜2ULN group of patients with CHB were significantly lower than ALT≥2ULN group（P＜0.05）；serum HBVDNA loads lower group（＞103⁃105copies／mL），middle group（＞105⁃107copies／mL）and higher group of HBVDNA（＞107⁃109copies／mL）CD31 molecule expression frequency were on the rise，but no statistically significant difference were observed in the comparison between groups（P＞0.05）；the percentages of CD31＋、CD31＋CD8＋、CD31＋CD4＋／CD4＋cells in the HBeAg⁃negative group were significantly lower than HBeAg⁃positive group（P＜0.05）.ConclusionsThe frequency of CD31 molecule expression on peripheral T lymphocytes of patients with CHB were declined；there is a certain relationship between the frequency of CD31 molecule expression and serum ALT levels，different loads of HBVDNA，HBeAg positive or negative in patients with CHB；chronic HBV infection of immune status may be associated with T cell surface expression of CD31 molecule frequency.

CD31 molecule；T lymphocytes；Chronic HBV infection

吕铁锋，Email：tiefenglv＠126.com；俞立飞，Email：yulifei1981＠sina.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

CD31分子；T淋巴细胞；HBV感染，慢性

杭州市医疗卫生及重点专科专病科研攻关专项（20130733Q31）

2016⁃8⁃27）