加工过程对脂肪球膜蛋白质的影响

（天津科技大学，天津300457）

加工过程对脂肪球膜蛋白质的影响

户行宇，于景华

（天津科技大学，天津300457）

综述了牛乳在加工过程中，经过加热、均质和喷雾干燥处理后，脂肪球膜（MFGM）自身蛋白质的变性反应及MFGM蛋白质与乳清蛋白、酪蛋白之间的交互变化，研究了这些变化的反应机理，为今后牛乳的加工条件提供理论依据。

脂肪球膜蛋白质，加热，均质，喷雾干燥

0 引言

乳脂肪以脂肪球的形式存在，其表面包被着由蛋白质和磷脂组成的具有乳化性的脂肪球膜[1]。超高温杀菌（UHT）乳因其货架期长，能够摆脱乳制品生产和消费的地区和季节限制，在我国液态奶市场上占有较高的比例。但由于UHT乳在加工过程中都要经过加热和均质，会导致乳脂肪球破裂，引起脂肪上浮。研究表明MFGM的组成和稳定性主要受加热和均质的影响[2]。目前，国内外许多关于MFGM的研究都集中在MFGM的组成和生理特性方面，很少有人关注牛乳在加工过程中，MFGM蛋白质的变化情况。而MFGM蛋白质作为牛乳系统乳化性的关键因素，其变化情况直接影响乳制品的稳定性及其品质。因此，有必要研究牛乳在加工处理过程中MFGM蛋白质发生的变化，为今后优化牛乳的处理工艺提供理论支持。

1 加热对MFGM蛋白质的影响

1.1加热对MFGM自身蛋白的影响

牛乳在50℃下加热10 min，MFGM蛋白质损失率达到50%左右[3]，但目前尚不清楚为什么在相对温和的环境中，MFGM蛋白质仍有大量损失。Zou利用荧光团标记的磷脂探针发现不同温度下，MFGM上神经鞘磷脂的质量分数会发生变化[4]，因此推测MFGM蛋白质损失的原因可能是由于此温度下磷脂在MFGM表面会重新分布，MFGM蛋白质与磷脂分离，进入乳清体系中。

BTN（嗜乳脂蛋白，占MFGM总蛋白质量40%以上）在加热到58℃时，发生变性，形成分子间二硫桥，XO（黄嘌呤氧化还原酶，占MFGM总蛋白20%左右）通过二硫桥与之相结合形成二硫键。当温度>60℃时，这种结合强度逐渐变小，到70℃时，两者之间的二硫键断裂，又被还原成单分子物质[2]。而PAS6与PAS7（组织糖蛋白高碘酸薛夫6/7）在加热过程中相对稳定。

1.2加热造成乳清蛋白与MFGM蛋白质的结合

加热时，乳清蛋白主要与MFGM中的XO和BTN结合。许多研究都表明牛乳在加热过程中，乳清中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白会与MFGM相结合。Aiqian Ye在实验中得到β-乳球蛋白和ɑ-乳白蛋白在65 ～95℃温度范围内加热时与MFGM的结合情况[5]。结果表明β-乳球蛋白在80℃以下和80℃以上表现出不同的结合速率。65 ～85℃范围内，结合速率缓慢，且质量分数随温度升高和加热时间的延长而增加，在85 ～95℃时，MFGM上吸附的β-乳球蛋白的质量在开始加热的几分钟内迅速增加达到最大值（推测原因可能是β-乳球蛋白变性后暴露出更多的二硫键），然后趋于稳定，而且最大值为1 mg/g，占乳中总β-乳球蛋白的1%左右。同样，α-乳白蛋白与MFGM结合情况遵循相同的规律，只是温度节点在80℃，达到的最大结合量为0.25 mg/g，占乳中总β-乳白蛋白的0.8%左右（在不同的泌乳期，两者的最大值均没有显著差异）。目前还没有弄清楚MFGM为什么只结合1%左右的乳清蛋白，但推测可能是因为酪蛋白胶束（直径50 ～300 nm）提供了一个比MFGM（直径0.5 ～10 μm）更好的吸附表面，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白在变性时，可能最先发生的是自身的结合或者与酪蛋白胶束的结合，剩下的乳清蛋白再与MFGM进行结合。

β-乳球蛋白的变性温度为78℃，也就是说β-乳球蛋白在变性之前就已经开始与MFGM发生结合。但是具体的结合机理尚不清楚，推测可能是β-乳球蛋白与MFGM通过巯基-硫化物交互反应进行结合，或者β-乳球蛋白通过竞争作用替代原有MFGM上的成分，或者β-乳球蛋白通过MFGM加热发生破裂时产生的缺口进入脂肪球内部，与脂肪发生结合。

综合1.1中XO和BTN的变性温度，可以推测在65 ～70℃温度范围内，β-乳球蛋白通过二硫键同XO-BTN复合物相结合；在70 ～78℃温度范围内，β-乳球蛋白通过二硫键分别与XO或BTN的单分子相结合；在78 ～95℃温度范围内，由于β-乳球蛋白的二硫键增多，与XO或BTN的单分子结合的速率会加快。

2 均质对MFGM蛋白质的影响

在液态乳加工过程中，典型的均质过程为将牛乳加热到60 ～70℃，一级均质压力为10 ～25 MPa，牛乳以极高的速率通过均质阀，脂肪球在湍流、剪切力和气穴现象的作用下破裂，导致脂肪球的聚集，促进脂肪上浮。二级均质压力为5 MPa，对一次均质后的乳提供有效的反压力，使一次均质后聚集的小脂肪球分开，重新形成小的脂肪球，抑制脂肪上浮，提高均质效果。

在均质过程中MFGM上的一些蛋白质与MFGM分离，进入脱脂乳相中，由于XO和BTN的亲油性，两者依然通过共价作用与脂肪酸连接，并且它们与两相之间的界面仍然存在紧密的联系。

均质过程中破裂的脂肪球表面会重新形成没有全部被脂肪球膜包裹的界面，因此乳中其他的一些活性蛋白成分会吸附到脂肪球表面，从而形成一个新的脂肪球膜。而酪蛋白就是主要的蛋白吸附片段，当均质时脂肪球与酪蛋白发生碰撞，酪蛋白胶束就会吸附到脂肪球上。由于均质会减小酪蛋白胶束的尺寸，因此，其与脂肪球的结合会非常容易。β-乳球蛋白是乳清蛋白中与脂肪球结合的主要蛋白质，同时还有一小部分α-乳白蛋白的结合[6]。在普通均质过程中，乳清蛋白占总吸附蛋白的5%，覆盖整个脂肪球20%的面积；当均质压力升高时，其比率会逐渐降低[7]。在商业化的超高温牛乳中，原有MFGM仍占整个脂肪球表面积的25%[8]。当采取微流化均质技术时，脂肪球表面的酪蛋白层会变薄，可能是酪蛋白胶束在微流化过程中会发生破裂。

3 均质与加热的不同顺序对MFGM蛋白质的影响

Lee总结了牛乳先加热后均质时，蛋白质的反应过程：乳清蛋白先发生变性，然后与MFGM自身蛋白质（XO，BTN，PAS6/7）或酪蛋白胶束发生结合反应，然后κ-酪蛋白-乳清蛋白复合物在均质过程中吸附到脂肪球表面，形成新的MFGM。而牛乳先均质后加热时，蛋白质的反应过程为：均质后形成的酪蛋白胶束的碎片吸附到脂肪球表面，加热后变性的乳清蛋白通过二硫键与原有MFGM蛋白质和酪蛋白连接[9]。

Lee认为当牛乳先均质后再加热（至80℃），脂肪球上吸附的酪蛋白和乳清蛋白会比牛乳先加热再均质时吸附的少，可能原因是当牛乳进行加热处理时，酪蛋白和乳清蛋白进行结合，形成κ-酪蛋白-乳清蛋白复合物，然后再通过均质产生的相互碰撞结合到新形成的MFGM上。而Sharma和Dalgleish得出的结论恰好相反[7]，他们认为当牛乳先均质后加热时，有更多的乳清蛋白与脂肪球发生交互反应，这表明新形成的MFGM比原有MFGM提供更多的乳清蛋白和酪蛋白粘合位点，如果先加热会造成蛋白质变性，与MFGM结合的倾向就会变小。针对两种截然不同的观点，我们需要针对乳清蛋白和酪蛋白与MFGM结合的机理进行深入研究。

在50℃下，用17 MPa和3.5 MPa的压力对牛乳进行二次均质会导致酪蛋白对MFGM的吸附，但是如果牛乳没有进行加热处理，就没有乳清蛋白的吸附。而MFGM上吸附的蛋白质总量（酪蛋白和乳清蛋白）对于加热处理前后是否经过均质并没有明显的不同[10]。

4 超高压均质对MFGM蛋白质的影响

高压均质技术（HPH）工作原理同普通均质技术类似，但是均质压力为50 ～200 MPa。它能分散不互溶的液相，使牛乳中脂肪球和酪蛋白胶束大小明显减小，因此经过高压均质的牛乳经过较长时间贮存仍具有良好的乳化性和稳定性，同时高压能降低牛乳中碱性磷酸盐的质量分数，抑制乳过氧化物酶的活性[11]，抑制微生物的生长[12]。然而，高压均质后的牛乳会导致原有风味的改变，而且高压均质的设备成本较高，目前还没有应用到实际生产中。但是，高压均质技术有可能应用到牛乳均质-巴氏杀菌一体化技术当中[11]。

前面提到HPH可以减小酪蛋白胶束的大小，目前的研究只能证明HPH可以减小脱脂乳中酪蛋白胶束的大小，酪蛋白胶束的直径从41 MPa的209 nm减小到186 MPa的190 nm。由于全脂乳中脂肪球成分复杂，还没有相关数据证明HPH是否可以降低全脂乳中的酪蛋白胶束大小。当均质压力为200 MPa，牛乳在均质机进口温度4，14，24℃时，脂肪球直径由(3.8±0.2)μm分别减小到(0.80±0.08)，(0.65±0.10)，(0.37±0.07)μm；用相同的压力对牛乳进行二次均质，乳脂肪球直径分布比较集中，大部分都在0.2 μm左右。当第一次均质压力达到300 MPa时，脂肪球会形成脂肪球串，使其上面的蛋白质更容易在SDS中分离，用10% ～20%的第一次均质压力对牛乳进行二次均质，则会抑制这种脂肪球串的形成[12]。

5 喷雾干燥对MFGM蛋白质的影响

喷雾干燥前，脂肪球的直径大小取决于均质时的压力，当均质压力为4 MPa时，脂肪球直径为(0.67± 0.01)μm；当均质压力为7 MPa时，脂肪球直径为(0.61±0.01)μm。加热温度70℃和90℃时，测量结果无显著性差异。然而，喷雾干燥后形成的乳粉具有相似的脂肪球大小，在上述的均质压力和温度下，脂肪球直径均为(0.50±0.01)μm，且小于喷雾干燥前的脂肪球直径[13]。说明乳粉的脂肪球大小与喷雾干燥前的浓缩乳的脂肪球大小是不相关的，即在喷雾干燥的过程中，脂肪球破碎，然后又重新形成新的脂肪球，而造成脂肪球破碎的原因可能是浓缩乳在经过旋转圆盘分离时，受到剪切力的作用，使脂肪球破碎，而且破碎程度相当剧烈。

Aiqian Ye对乳粉脂肪球膜上分离出的蛋白质进行分析，发现蛋白质质量分数高于浓缩乳MFGM蛋白质的质量分数，同时，低压（4 MPa）均质后的乳粉膜蛋白质量分数高于高压（7 MPa）均质的乳粉膜蛋白质量分数。值得注意的是，在喷雾干燥前后，蛋白质在脂肪球膜上的覆盖面积基本无变化。大量的蛋白质电泳条带显示乳粉MFGM上酪蛋白的质量分数比浓缩乳MFGM上酪蛋白（主要是κ-酪蛋白）的质量分数稍微高一些，而前者β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和MFGM自身蛋白质的质量分数却略微低于后者。说明在新的脂肪球膜重新形成的过程中，脂肪球膜上的蛋白质也在发生变化，可能原有MFGM蛋白质与MFGM分离，乳清中的其他蛋白质与MFGM发生结合。乳粉表面κ-酪蛋白与β-乳白蛋白的比率（0.65± 0.03）略微高于浓缩乳中的比例（0.60±0.02），说明在新的脂肪球表面吸附的主要蛋白质为酪蛋白胶束，而且这种吸附作用导致MFGM自身蛋白质和β-乳球蛋白、α-乳白蛋白的减少，同时也表明喷雾干燥不会引起β-乳球蛋白、α-乳白蛋白与MFGM的结合。喷雾干燥对乳清蛋白的变性没有明显的影响，只有免疫球蛋白的质量分数出现不明显的下降，血清白蛋白有一小部分的损失。

当浓缩乳离开喷雾圆盘，进入干燥空气中时，乳滴表面水分开始蒸发，可能会降低脂肪表面蛋白质的扩散速率，尤其是在新形成的原有乳滴表面的未覆盖蛋白质的脂肪球表面，这可以解释为什么喷雾干燥后在新形成的乳粉颗粒表面MFGM自身蛋白质减少。最近有研究表明，重新形成的乳滴的脂肪球内表面在雾化后的干燥阶段存在少量蛋白质，但尚未确定存在的机理[14]，仍需进一步的研究。此外，乳粉颗粒表面的脂肪球与干燥乳滴空气-水表面相接触，会导致脂肪球膜的损失，进而造成脂肪在乳粉颗粒表面的扩散。

乳粉表面脂肪和脂肪球的大小分布具有重要的现实意义，目前已经用显微技术观察到表面脂肪在全脂乳粉和复原全脂乳颗粒上的分布，但是不清楚在脂肪-空气接触处是否有蛋白质单分子层的吸附。从CSLM镜像中观察到表面脂肪可能并没有被吸附的蛋白层覆盖，而这种表面脂肪的形成和喷雾干燥前的加工处理对脂肪球造成的破坏并没有相关性，但是由于表面脂肪的存在，乳粉颗粒在喷雾干燥后的处理（成团、贮存）中会更容易形成较大的乳粉颗粒，对乳粉品质造成不良影响。因此，对于表面脂肪的形成过程还需要更深入更系统地研究，以便解决乳粉在加工后和储存中的品质问题。

6 展望

目前，由于技术限制对MFGM的研究还不成熟，在未来的研究中，需要进一步依托一些领域的高新技术，例如蛋白互作分析技术中的蛋白质亲和色谱，某种特定的蛋白质与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，然后通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来，从而达到分离单组份蛋白质的效果。其他技术还包括蛋白质碎片分析、质谱分析、染色体组及蛋白质组学技术等[15]，这些科技的发展有助于分离鉴定MFGM中的复杂组分，使人们对MFGM蛋白有更加充分的了解，从而更好地解决乳制品在加工和消费过程中出现的问题。

[1]LOPEZ C．Milk fat globules enveloped by their biological mem⁃brane：Unique colloidal assemblies with a specific composition and structure[J]．Current Opinion in Colloid&Interface Science，2011，16（5）：391-404．

[2]MULDER H W．The milk fat globule[M]．Farnham Royal/Eng⁃land：Bucks/Common wealth Agricultural Bureaux，1974．

[3]YE A，SINGH H，TAYLOR M W，et al．Characterization of pro⁃tein components of natural and heat-treated milk fat globule mem⁃branes[J]．International Dairy Journal，2002，12（4）：393-402．

[4]ZOU XQ，GUO Z，JIN Q Z．Composition and microstructure of colostrum and mature bovine milk fat globule membrance[J]．Food Chemistry，2015，5（185）：362-370．

[5]YE A，SINGH H，OLDFIELD D J，et al．Kinetics of heat-induced association of β-lactoglobulin and α-lactalbumin with milk fat glob⁃ule membrane in whole milk[J]．International Dairy Journal，2004，14（5）：389-398．

[6]LEE SJ，SHERBON JW．Chemical changes in bovine milk fat glob⁃ule membrane caused by heat treatment and homogenization of whole milk[J]．Journal of Dairy Research，2002，69（4）：555-567．

[7]SHARMA SK，DALGLEISH DG．Effect of heat treatments on the incorporation of milk serum proteins into the fat globule membrane of homogenized milk[J]． Journal of Dairy Research，1994，61：375-384．

[8]LOPEZ C．Focus on the supramolecular structure of milk fatin dairy products[J]．Reproduction Nutrition Development，2006，45（4）：497-511．

[9]LEE S J．Chemical changes in milk fat globule membrane due to heat treatment and homogenization of whole milk[D]．Thesis Cornell Uni⁃versity，USA，1997．[10]MARIE-CAROLINE M，CAROLINE J．Does homogenization af⁃fect the human health properties of cow's milk[J]．Trends in Food Science&Technology，2006，17（8）：423-437．

[11]HAYES M G，FOX P F，KELLY A L．Potential applicationsof high pressure homogenization in processing of liquid milk[J]．Jour⁃nal of Dairy Research，2005，72（1），25-33．

[12]THIEBAUD M，DUMAY E，PICART L，et al．High-pressure ho⁃mogenisation of raw bovine milk．Effects on fat globule size distribu⁃tion and microbial inactivation[J]．International Dairy Journal，2003，13（6）：427-439．

[13]YE A，ANEMA SG，SINGH H．Behaviour of homogenized fat globules during the spray drying of whole milk[J]．International Dairy Journal，2007，17（4）：374-382．

[14]FOERSTER M，GENGENBACH T，WOO M W，et al．The im⁃pact of atomization on the surface composition of spray-dried milk droplets[J]．Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2016，1（140）：460-471．

[15]EL-LOLY M M．Composition，properties and nutritional aspects of milk fat globule membrane-a review[J]．Polish Journal ofFood and Nutrition Sciences，2011，61（1）：27-32．

Effect of the processing of fat globule membrane proteins

HU Hang-yu,YU Jing-hua
(Tianjin university of science an technology,Tianjin 300457,China)

The paper reviewed the changes of fat globule membrane(MFGM)protein denaturation reaction itself and the MFGM protein in⁃teractions with whey proteins and casein during heating,homogeneity and spray drying process.Mean while,the reaction mechanisms of these changes have been studied to provide theoretical bases for milk processing conditions in the future.

MFGM protein;heating;homogeneity;spray drying

TS252.42

B

1001-2230（2016）11-0032-03

2016-03-29

国家自然科学基金(31271904)。

户行宇(1993-)，女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与工程。通讯作者：于景华