鸭肠炎病毒基因研究现状

杜翔宇，胡桂学，董浩

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）

鸭肠炎病毒基因研究现状

杜翔宇1，胡桂学2，董浩1

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）

鸭病毒性肠炎具有流行广、传播快，发病率和死亡率高等特征［1］，自1923年首次报道该病以来，世界多个国家都先后有此病暴发的报道，对养鸭业造成巨大的经济损失，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。鸭病毒性肠炎对不同性别和年龄的鸭均可致病，对成年鸭的危害最为严重，其特征为侵害血管、消化道黏膜糜烂、组织出血、淋巴器官病变及其实质器官有退行性病变。康复后的鸭仍可能带毒和排毒，导致该病在鸭群中广泛地传播，严重的影响了养鸭业的发展，造成巨大的经济损失。

Plumme和Hansen等的工作为DEV基因组结构的研究开辟了先河，在1998年Plummer等首次报道了DEV部分UL6及UL7的基因序列、在1999年Hansen等首次报道了DEV部分UL30基因，此后人们对DEV基因组有了全新认识［2］。随着分子生物学的迅速发展，鸭瘟病毒的分子生物学研宄也在不断深入，DEV基因组序列先后被报道，包括TK、gH全基因序列、UL24基因序列［3-5］，与此同时对这些基因的分子特征、结构及编码蛋白的功能作出了预测。众多疱疹病毒的基因组序列已经被测定出来，并且逐渐向基因的相关特性及功能、鸭肠炎病毒的复制机理、感染机制、疫苗的制备等方面深入地进行，为深入探索鸭肠炎病毒感染的发病机理提供了科学数据。

1鸭肠炎病毒的生物学特性

鸭肠炎病毒是α-疱疹病毒亚科的成员，具有疱疹病毒典型的形态结构，并且不同毒株之间均可产生交互免疫。病毒粒子为大的球形且带囊膜的病毒，直径为120～200 nm，结构主要由衣壳、外膜、囊膜、核心4部分组成。DEV病毒衣壳为二十面体对称，外观呈六角形，由162个相互连接呈放射状排列并且有中空轴孔的壳粒组成，核心是由双股线状DNA与蛋白缠绕而成，直径约为35～40 nm；DEV可以在鸭胚成纤维细胞上增殖且形成核内包涵体、也可形成蚀斑，DEV无血凝和血细胞吸附特性。

病毒基因组为线性双链DNA，长度在125 kb～240 kb之间，G+C含量在32%-75%之间。DEV基因组与其他疱疹病毒基因组结构类似，整个基因组分为短独特区（Unique Short Region，US），长独特区（Unique Long Region，UL），末端重复序列（terminal repeat，TR）及反向重复序列（Inverted Repeats，IR）。由于囊膜糖蛋白是疱疹病毒的主要保护性抗原，它们在介导病毒进入细胞，以及病毒的成熟与释放过程中均起重要的作用，因此对疱疹病毒的结构蛋白中囊膜糖蛋白的研究显得尤为重要。

2鸭肠炎病毒基因研究现状

目前共有12个囊膜糖蛋白被命名，其中gB、gC、gH、gJ、gK、gL、gM、gN由UL区段编码，gD、gE、gG、gl由US区段编码，各囊膜糖蛋白在病毒感染细胞的病理过程和免疫原性中具有不同的功能。

2.1UL区基因鸭肠炎病毒基因所编码的蛋白功能不尽相同，有的在膜的融合中起作用，有的介导病毒与肝素样受体的结合，有的参与病毒的穿透过程，介于此关于鸭肠炎病毒基因部分特性及其原核表达蛋白应用的研究被广泛关注。陈希文［6］对鸭肠炎病毒UL18基因的部分特性以及原核表达蛋白的应用进行了研究，结果表明，DEV UL18基因大小为969 bp，编码了由322个氨基酸残基组成的多肽，相对分子量为35.25 kD，等电点理论值为8.37，采用实时荧光定量RT-PCR方法和Western Blot技术检测病毒感染鸭胚成纤维细胞（DEF）之后DEV UL18基因的转录以及蛋白表达情况，推测该基因是病毒晚期基因。潘华奇［7］成功地克隆了鸭肠炎病毒gB基因，并对表达产物的初步应用进行了研究，是与其他疱疹病毒具有同源性的DEV UL25，UL26，UL26.5，UL27新基因的序列，分别构建了含DEV gB蛋白N端和中部抗原性较好的抗原域编码基因的两个原核表达质粒，利用Western Blot技术检测蛋白，证明扩增基因是DEV所编码的，并且得知DEV gB蛋白有良好的抗原性，是疱疹病毒囊膜糖蛋白B家族成员。黄杰［8］做了鸭瘟病毒UL7基因生物信息学的分析，表明DPVUL7基因含1个保守结构域、编码的产物无跨膜区和信号肽、具有1个潜在的酰基化位点、12个潜在的糖基化位点和磷酸化位点，对亚细胞进行定位，结果表明，UL7蛋白主要位于细胞质，应用Western Blot分析显示，表达的产物可与兔抗DPV多克隆抗体发生特异性反应，对鸭瘟病毒UL7基因的类型及转录时相分析，结果表明，UL7基因是DPV的一个晚期基因。

部分关于鸭肠炎病毒基因的研究仅见于序列分析及编码蛋白的归类，而具体作用及非复合物形式的蛋白的功能的研究尤为重要。蔺萌［9］初步研究了鸭肠炎病毒gN基因及功能，基因大小为288 bp，编码95个氨基酸，含有2个跨膜区域和1个信号肽区。对DEV gN基因的分子特征分析，结果表明，DEV gN基因具有特异性，可以作为一个区别DEV与其他病毒的特异基因，同时建立了基于DEV gN基因的PCR扩增检测方法，并应用于DEV的临床诊断，该检测方法能特异性地检出DEV，最低可以检测到0.1 ng/μL的DEV DNA。姜龙［10］对鸭瘟病毒UL49的基因功能进行研究，分析其生物信息学，研究表明，DPV UL49基因编码VP22蛋白，该蛋白由253个氨基酸组成，分子量约为27 864，蛋白大小为575 Da；制备分离兔抗重组VP22蛋白高免血清，效价最高的达到1∶32；应用Western Blot检测其能够与纯化的VP22重组蛋白结合，具有很强的特异性；研究DPV UL49基因RNA干扰有效靶点的筛选及对病毒重要糖蛋白基因转录的影响，结果表明，RNAi质粒VP22-505可抑制DPV UL49基因转录，同时对DPV糖蛋白基因gB、gE和gD的转录也有很强的抑制作用。刘峰源［11］利用Tail-PCR克隆了鸭肠炎病毒完整的gC基因和部分UL43基因的序列，并进行序列测定，gC基因全长1 296 bp，编码431个氨基酸；利用Western Blot证明，表达的DEV gC蛋白具有良好的抗原性；利用纯化重组的gC蛋白，进行淋巴细胞增殖试验，检测刺激产生IFN-γ的水平，证明gC基因具有刺激机体细胞免疫的功能。

对鸭肠炎病毒基因缺失株生物学特性进行初步研究，以期为今后的鸭瘟病毒相关研究提供参考。孙昆峰［12］选取鸭瘟病毒gC基因作为保护性抗原构建基因疫苗，并初步对gC、gE的功能以及相应缺失株、对鸭的致病性和免疫的保护作用，证实了gC缺失使鸭癌病毒的滴度下降，促进了感染鸭胚成纤维细胞的融合，降低了病毒的毒力；gC缺失株可诱导较高的中和抗体，可保护免疫鸭免受鸭瘟强毒攻击。证实gE非鸭瘟病毒复制必需基因，但gE缺失显著降低了鸭癌病毒的空斑形成能力和病毒毒力，gE缺失株可以为免疫鸭提供完全保护，有望发展成区分人工免疫和强毒自然感染的新型基因工程疫苗。杨承槐［13］对鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列进行测定与分析，此毒株基因组全长为162 131 bp，共有78个ORF，编码76个蛋白；DEV经鸡胚成纤维细胞连续传代后可导致gE和gl基因缺失，使其失去对鸭的致病力，DEV CSC经鸡胚成纤维细胞传代后致弱的第80代毒有良好的免疫原性；此研究构建了缺失gE和gL基因的DEV突变株，gE和gL基因的缺失，可以降低病毒的复制能力及致病性，DEV gE和gL基因对病毒在细胞间的传播以及毒力具有重要的影响。

研究鸭肠炎病毒基因在宿主细胞内的转录情况对了解病毒基因的特点和功能有重要意义，可为进一步开展鸭肠炎病毒基因的功能等研究提供基础试验数据。石勇［14］对鸭瘟病毒UL21基因进行了生物信息学分析、鸭瘟病毒UL21基因全长1 686 bp，预测编码561个氨基酸大小的蛋白，理论分子量约62 kD，此蛋白含有3个潜在的糖基化位点、27个潜在的磷酸化位点，无信号肽和跨膜区域，重组表达的蛋白主要是以包涵体的形式存在，对其进行琼脂扩散试验，结果发现最高免疫抗血清效价达到了1∶16，成功地制备了兔抗DPV UL21重组蛋白多克隆抗体，应用实时荧光定量反转录PCR法分析其基因转录时相，证明DPV UL2属于一个晚期基因。娄昆鹏［15］研究了鸭瘟病毒UL28基因的克隆、原核表达、细胞定位及转录时相，对鸭瘟病毒UL28基因序列的分子特性进行分析，DPV UL28基因大小为2 412 bp，编码803个氨基酸，含有1个保守结构域；Westem Blot检测显示，可以识别重组表达的蛋白，琼脂扩散试验效价达到1∶16～1∶32；转录时相分析鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL28基因，得知转录谱具有疱疹病毒早期基因的典型特征。沈爱梅［16］对DEV UL45基因的分子特性分析，该基因大小为675 bp，编码224个氨基酸，等电点为6.51；免疫印迹结果表明，制备的抗体能特异性的识别UL45蛋白，并且证明UL45基因是DEV基因组的组成部分；UL45基因编码蛋白属性分析结果表明，该蛋白存在于纯化病毒和上清中，推测UL45蛋白是病毒的囊膜蛋白，DEV UL45基因转录特性研究表明，该基因属于晚期基因。

2.2US区基因针对鸭肠炎病毒US区基因的相关特性和功能开展初步研究，可为深入了解鸭病毒性肠炎感染的发病机理提供科学数据。范薇［17］对鸭瘟病毒gD基因及其重组蛋白的应用展开研究，结果表明，该基因的ORF属于疱疹病毒gD基因家族，是DPV的gD基因。gD基因编码区（ORF）全长为1 269 bp，C+G含量为44%。编码的gD蛋白含有422个氨基酸，分子量是47.5 kD。获得了原核表达gD蛋白，并具有免疫反应性，经全病毒DPV ELISA方法验证，本研究建立的重组gD蛋白间接ELISA检测方法与其在检出率上差异不显著，可用于临床血清学监测。信洪一［18］通过基因组文库首次证实了DEV US3基因，制备高纯度的抗DEV US3蛋白IgG，并且利用该方法检测了20株临床鸭瘟的阳性样本，结果显示检出率为100%；成功建立了DEV US3基因原核表达蛋白的间接ELISA检测抗DEV抗体的方法，结果表明，最适抗原包被浓度为2.2 μg/mL，最适待检血清稀释度为1∶320；最适二抗稀释度为1∶2 000；临床结果显示，此PCR方法检出率效果好，可应用于临床检测DEV。

gE是疱疹病毒复制非必须的病毒主要毒力基因之一，阐明gE基因编码产物的功能，为生产实践中应用提供了理论依据。乌伊罕［19］对DEV gE基因编码蛋白的结构、抗原性及与其他疱疹病毒的同源性等做了详尽的生物信息学分析，原核系统中表达的gE成熟蛋白（60 kDa）、gE成熟蛋白胞内区（20 kDa）及胞外区（50 kDa）都可以与DEV阳性血清发生特异性的免疫反应，构建了转移载体pUC19-gE-EGFP，转染DEF后可观察到特异的绿色荧光，由此说明，EGFP基因有效的表达，为进一步研究基因缺失、重组病毒等方面奠定了基础，为预防和研制鸭、鹅等水禽类疫病的基因工程疫苗提供技术平台。常华［20］初步对鸭瘟病毒gE基因功能进行研究，结果显示，该基因含有信号肽切割位点，编码490个氨基酸的多肽，构建原核载体pET32a/DPV-gE，重组蛋白大小约为74 kD，主要以包涵体的形式存在，采用间接免疫酶组化方法（IPA）检测DPV gE蛋白感染鸭组织的分布规律，建立间接ELISA法并应用其检测重组蛋白pET32a/DPV gE鸭瘟病毒抗体，为后续研究DPV gE基因的功能奠定了基础。

2.3其他基因序列关于鸭肠炎病毒基因组结构仍然没有彻底研究清楚，导致与此相关的基础研究无法深层次的展开，因此对这些未知序列进行测定具有重要意义。陈普成［21］克隆了鸭瘟病毒部分基因组序列，并构建了重组病毒转移载体，研究得到完整病毒基因组的DNA，大小位于145-194 kb之间；扩增获得了鸭瘟病毒US1、US7、US8、UL41及UL42五个基因和部分末端反向重复序列；进化树分析，结果表明，DEV UL41基因与а疱疹病毒亚科其他成员进化关系相对较远，而US7、US8及UL42基因的进化树表明DEV与火鸡疱疹病毒、马立克病毒的关系相近，为鸭瘟病毒的分类提供了参考依据。高亚东［22］研究DEV Clone-03的基因组未知序列，完成了DEV Clone-03基因组，DNAUS和UL区段共扩增出28 240 bp的核甘酸序列；同源性分析总体表明，DEV Clone-03与α疱疹病毒的同源性高于β疱疹病毒及γ疱疹病毒的同源性；构建了的系统发育进化树表明DEV Clone-03属于α疱疹病毒亚科，就多数基因而言，DEV Clone-03和MDV更接近。

3结语

目前，关于鸭肠炎病毒基因研究取得了一定的成绩，以分子生物学技术为主要手段，对DEV基因进行了生物信息学分析，从病毒遗传演化、基因分子特征、编码蛋白结构和功能进行研究，探索了鸭肠炎病毒基因缺失构建的方法，研发应用于临床检测DEV的方法，为DEV的基因组结构、归属和致病性的深入研究，为阐明DEV部分基因编码蛋白在病毒感染、复制过程中的作用以及新型基因工程疫苗研制提供分子生物学依据。

但在UL区和US区的结合部以及两侧末端的重复序列仍然未知，基因组的结构仍未彻底研究清楚，病毒基因的功能、病毒在机体细胞或者组织中的复制机理、病毒感染的过程、机体抗病毒感染机制等诸多方面研究有许多不明之处均有待进一步深入；但已克隆出的这些基因及其编码产物具有何种生物学功能，它们对于病毒的复制、致病性及其产物鸭病毒性肠炎预防、控制作用需要更多更细致的研究；DVE的病原性在不断变异，根据DVE病毒本身的生物学和生态学特性，如何应用分子生物学技术构建基因疫苗也成为研究重点。

［1］Sandhu T S，Shawky S A.Duck virus enteritis（duck Plagure）.In：SaifY M，Varnes H J，Glisson J R，et al.11 th Eds Disease of Poultry［J］.Ames：lowa State University Press，2003，354-363.

［2］Hansen W R，Brown S E，Nashold S W，et al.Identifieation of duck Plague virus By Polymerase chain reaction［J］.Avian diseas，1999，43：106-115.

［3］Han X J，Wang J W.Cloning of thymidine kinase gene of duck Plague virus using degenerate PCR［J］.Agric Sci China，2005，4（8）：634-640.

［4］Han X，Wang J，Ma B.Cloning and Sequence of Glycoprotein H Gene of Duck Plague Virus Agric［J］.SciChina，2006，5（5）：397-402.

［5］Li H，Liu S，Kong X.Charaeterization of the genes encoding UL24，TK and gH Proteins from duck enteritis Virus（DEV）：a proof for the classifieation of DEV［J］.Virus Genes，2006，33（2）：221-227.

［6］陈希文.鸭肠炎病毒UL18基因部分特性及其原核表达蛋白应用的研究［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［7］潘华奇.鸭肠炎病毒gB基因的克隆与表达及其产物的初步应用［D］.兰州：甘肃农业大学，2007.

［8］黄杰.鸭瘟病毒UL7基因的原核表达_多抗制备及其应用［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［9］蔺萌.鸭肠炎病毒gN基因及其功能的初步研究［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［10］姜龙.鸭瘟病毒UL49基因功能研究［D］.雅安：四川农业大学，2012.

［11］刘峰源.鸭肠炎病毒糖蛋白gC基因的克隆_表达及部分功能的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2008.

［12］孙昆峰.鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内分布缺失株的构建和生物学特性的初步研究［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［13］杨承槐.鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性［D］.北京：中国农业大学，2014.

［14］石勇.鸭瘟病毒UL21基因的克隆表达与转录时相分析［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［15］娄昆鹏.鸭瘟病毒UL28基因的克隆_原核表达_细胞定位和转录时相研究［D］.雅安：四川农业大学，2009.

［16］沈爱梅.鸭肠炎病毒UL45基因去跨膜区原_省略_制备_转录时相及编码蛋白特性研究［D］.雅安：四川农业大学，2013.

［17］范薇.鸭瘟病毒gD基因发现及重组蛋白应用研究［D］.雅安：四川农业大学，2012.

［18］信洪一.鸭瘟病毒US3基因的发现原核表达及应用研究［D］.雅安：四川农业大学，2009.

［19］乌伊罕.鸭肠炎病毒gE基因部分功能研究与转移载体构建［D］.哈尔滨：东北农业大学，2009.

［20］常华.鸭瘟病毒gE基因功能初步研究［D］.雅安：四川农业大学，2011.

［21］陈普成.鸭瘟病毒部分基因组序列的克隆及重组病毒转移载体的构建［D］.北京：中国农业科学院，2009.

［22］高亚东.鸭肠炎病毒新基因的序列测定及其序列分析［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2007.

S852.61+2

A

0529-6005（2016）08-0071-03

2016-02-26

吉林省科技发展计划项目（20130522086JH）；高等学校博士学科点专项科研基金（20112223110002）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项资金（201231）；吉林省教育厅科学技术研究项目（2015209）

杜翔宇（1989-），女，硕士生，从事分子病原微生物与分子免疫学研究，E-mail：dxy1209@163.com

董浩，E-mail：donghao_jlau@163.com