恒河猴蜡样芽孢杆菌感染引起肾病的病理诊断报告

李 恒 ， 佘锐萍 ， 吴桥兴 ， 石蕊寒 ， 胡凤娇 ， 李 威 ， 张 洋

(中国农业大学动物医学院，北京海淀100193)



恒河猴蜡样芽孢杆菌感染引起肾病的病理诊断报告

李 恒 ， 佘锐萍 ， 吴桥兴 ， 石蕊寒 ， 胡凤娇 ， 李 威 ， 张 洋

(中国农业大学动物医学院，北京海淀100193)

采用组织病理学、超微病理学、分子生物学结合病原学检测方法对北京某研究中心的病死恒河猴进行了观察分析，结果表明，该恒河猴因蜡样芽孢杆菌感染引起渗出性肺炎、肾病，最终因呼吸障碍而死亡。

恒河猴 ； 肾病 ； 蜡样芽孢杆菌 ； 淀粉样变

恒河猴是我们国家的二级保护动物，也是常见的实验动物。与其他哺乳类实验动物相比，恒河猴在生物进化上与人类更为接近，因而，被广泛地应用于生物医学、行为学、进化学等领域的研究[1]。国内关于恒河猴疾病的报道并不多见，王衡[2]等曾经报道过1例恒河猴感染肺结核的病理诊断报告，其他疾病还很少见有报道。

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)是一种在自然界中广泛分布的好气、中温、产芽孢的杆菌，也是食品中常见的污染菌[3]。蜡样芽孢杆菌作为条件致病菌，在机体处于正常免疫状态下不具有致病性，而当机体免疫力下降时，此细菌能够引发脑膜炎、肺炎或败血症[4]。

本文报道了1例因蜡样芽孢杆菌感染引起恒河猴急性肺炎和肾病的死亡病例，对其病理变化特点、细菌分离培养鉴定进行了观察和描述，为进一步防止此类疾病的发生，保护恒河猴的健康提供借鉴与参考。

1 病例简介

2015年1月由北京某大学实验动物研究中心送检病死恒河猴1只，4岁，雄性，病程2 d，死亡前半天口角流血，呼吸急促，精神不振。

2 材料与方法

2.1 取材 取恒河猴内脏器官于25 mL/L 戊二醛-多聚甲醛混合液充分固定后，常规方法制成石蜡切片，分别进行H.E.染色，刚果红染色，甲基紫染色，PAS染色，Mallory三色染色。重点观察心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脾脏的病理学变化，OLYMPUS显微镜拍照。

2.2 染色方法

2.2.1 H.E.染色按常规染色方法进行。

2.2.2 刚果红染色 (1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)Harris 苏木精染色10～15 min，自来水冲洗数分钟；(3)1%盐酸乙醇分化数秒钟，温水显蓝，自来水冲洗数分钟；(4)甲醇刚果红染色15 min，自来水冲洗数分钟；(5)0.2%碱性乙醇分化数秒钟，自来水冲洗；(6)常规脱水、透明、封片；(7)显微镜观察，淀粉样物质呈砖红色。

2.2.3 高锰酸钾-刚果红染色(1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)5%高锰酸钾与0.3%硫酸等比例混合滴片3 min，蒸馏水洗；(3)1%草酸漂白数秒，蒸馏水洗；(4)其他同刚果红染色；(5)显微镜观察，AL型淀粉样物质呈砖红色，AA型淀粉样物质不显色。

2.2.4 甲基紫染色 (1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)1%甲基紫染色5 min，蒸馏水冲洗；(3)1%醋酸水溶液分化，直至呈现粉红色或红色，胞核呈蓝色，蒸馏水冲洗；(4)甘油固封；(5)显微镜观察，淀粉样物质亮紫色。

2.2.5 PAS染色 (1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)0.5%～1%高碘酸氧化5～10 min，蒸馏水速洗1次；(3)Schiff氏液37℃避光染色30～60 min；(4)0.5%偏重亚硫酸钠(钾)浸洗2 次，每次1～2 min，流水冲洗5～10 min，蒸馏水速洗2 次；(5)Harris苏木精染10～15 min，蒸馏水洗；(6)1%盐酸乙醇分化数秒钟，温水显蓝，自来水冲洗数分钟；(7)常规脱水、透明、封片；(8)显微镜观察，糖类、糖蛋白呈红色或紫红色。

2.2.6 Mallory 三色染色 (1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)重铬酸钾液染色10～15 min，蒸馏水冲洗；(3)酸性复红液染色2 min，蒸馏水冲洗；(4)苯胺蓝液染色20 min，95%乙醇快速分化；(5)常规脱水、透明、封片。

2.3 细菌分离培养 对肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏用普通琼脂和麦康凯培养基做细菌培养。挑取培养基上的菌落，进行革兰染色。镜检。

2.4 细菌PCR检测、测序 细菌纯培养后，挑取单个菌落用16S RNA细菌通用引物进行PCR检测，上游引物序列为gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列为ctahagggtatctaatcct，目的片段大小约为750 bp。

PCR体系：Taq酶12.5 μL，待检模板1 μL，上下游引物各1 μL，灭菌水9.5 μL，PCR反应程序为95 ℃(5 min)；94 ℃(1 min)，55 ℃(30 s)，72 ℃(90 s)，共35 个循环；72 ℃(8 min)。PCR扩增产物送华大基因科技服务有限公司测序。

2.5 扫描电镜观察对肺脏组织划线纯培养后的细菌进行扫描电镜观察。

3 结果

3.1 大体剖解观察 送检恒河猴的口腔内有红色分泌物，食管内有大量黏液，黏膜面潮红(见中插彩版图1)，胃臌气(见中插彩版图2)，脾脏萎缩(见中插彩版图3)。肾脏皮质区发白(见中插彩版图4)，肝脏表面散在针尖状出血点(见中插彩版图5)，肺脏散在多发性暗红色小叶性肺炎灶(见中插彩版图6)。

3.2 组织病理学观察结果

3.2.1 肾脏 出现典型的肾病病理变化。肾小管上皮细胞弥漫性变性、坏死，核固缩或消失。大部分肾小球萎缩，肾球囊被蛋白样物质填充，肾间质出血、水肿，未见炎性细胞浸润(见中插彩版图7，8)。

3.2.2 肺脏 肺泡结构被破坏，肺泡腔被淋巴细胞和大面积蛋白样渗出物填充(见中插彩版图9)。

3.2.3 心脏 心肌纤维断裂呈波浪状，变性、坏死(见中插彩版图10)。

3.2.4 脾脏 脾脏白髓萎缩，部分白髓坏死，中央动脉周围淋巴细胞明显减少(见中插彩版图11)。

3.2.5 肝脏 肝窦淤血、水肿(见中插彩版图12)。

3.3 肾脏特殊染色结果 肾脏的特殊染色结果显示，刚果红染色呈砖红色(见中插彩版图13，14)，高锰酸钾处理后，刚果红染色无阳性(见中插彩版图15)。甲基紫染色背景蓝紫色，淀粉样物质呈亮紫色(见中插彩版图16)。PAS染色显示，肾小球、肾小管基底膜呈深红色，肾小管中出现红染的均匀物质，呈紫红色(见中插彩版图17)。三色染色显示，无明显纤维增生(见中插彩版图18)。

3.4 细菌分离培养及革兰染色结果 肝脏、肾脏、脾脏和肺脏划线培养结果，只有肺的划线处有细菌菌落生长。挑取此菌落做革兰染色结果显示，肺脏划线培养后的细菌为短杆状或链状的蓝紫色细菌，为革兰阳性短杆菌(见中插彩版图19)。

3.5 扫描电镜观察结果 扫描电镜观察显示，肺脏组织划线纯培养的细菌为形态一致的平直的杆状或链杆状菌(见中插彩版图20)。

3.6 细菌PCR检测结果 PCR 扩增结果显示，从肺脏的细菌菌落检测到一条750 bp 大小的DNA条带(见中插彩版图21)，与预期扩增片段相符，而阴性对照未检测到任何片段，对PCR扩增产物进行测序，登陆GenBank进行blast比对，肺脏中的细菌与现有报道的蜡样芽孢杆菌同源性高达100%。登录号：KT239371。

4 讨论

恒河猴作为人类进行生命科学研究重要的实验动物，与人类的关系密不可分。根据文献报道，恒河猴在与人类疾病相关的基因及药物靶位点上有高度的相似性[5]，因此我们应当重视对恒河猴疾病的诊断。

从大体剖检变化来看，该病死恒河猴的肺为典型的小叶性肺炎变化，脾脏明显萎缩，肾脏皮质色淡，结构模糊。从组织病理学观察结果来看，肝脏明显的淤血，肝细胞水肿；出血性渗出性肺炎。肾脏表现出典型的肾病病理变化：肾小球萎缩，部分肾小球代偿性肿胀，肾小管出现大面积的变性坏死，而炎症变化不明显。

引起肾病的原因很多，肾病的类型也分很多种。常见的肾病包括淀粉样变性肾病，糖尿病肾病。淀粉样变性是一组以细胞外淀粉样物质沉积为特征的系统性疾病。根据沉积物生化成分不同，淀粉样肾病主要分为淀粉样轻链(AL)和淀粉样相关(AA)蛋白两型。AL 型包括原发型、伴发骨髓瘤型，常累及心、舌、胃肠道、神经和皮肤；AA型又称继发型淀粉样变性，常累及肝、肾、肾上腺、脾[6]。而刚果红和甲基紫两种染料与淀粉样物质有着极强的亲和力[7]，故临床上常用于淀粉样物质沉积的检测。本病例中肾小球的血管球周围，肾小管管腔内均呈砖红色，甲基紫染色呈亮紫色，说明在坏死的肾小球和肾小管等部位有大量淀粉样物质沉积。经过高锰酸钾处理之后的刚果红染色可以区分淀粉样变的轻链蛋白型(AL 型)和淀粉样蛋白型(AA 型)[8]。从中插彩版图15中可以看到，肾脏组织内几乎没有阳性信号，说明该病变可能与淀粉样蛋白型有关，即继发型淀粉样变性肾病。PAS染色能够显示糖类物质，对糖尿病肾病的鉴别诊断也有一定的指导意义[9]。本病例中肾小球、肾小管基底膜显色清晰，无明显增厚，无典型的糖尿病肾病病理变化。Mallory三色染色显示肾脏无明显的纤维增生。

PCR扩增结果显示，肺脏为蜡样芽孢杆菌感染、肝脏、脾脏、心脏、肾脏未检测出细菌。虽然蜡样芽孢杆菌是一种食源性细菌，当机体免疫力下降或某些重病后期，蜡样芽孢杆菌可引起脑膜炎、肺炎或败血症，并常见于新生胎儿感染[4]。Edward J.Bottone[10]报道过蜡样芽孢杆菌引起人全身性感染的病例，该报道观察发现，蜡样芽孢杆菌可引起人明显的呼吸道损伤。Dabscheck G[11]曾报道，蜡样芽孢杆菌感染引起儿童白血病的病例。蜡样芽孢杆菌虽为条件致病菌，但其致病性仍旧不能忽视。本病例中，我们在病死恒河猴的肺脏中分离培养出了细菌菌落，经PCR检测，扩增产物进行测序，登陆GenBank登录号：KT239371对比分析结果显示，与现有报道的蜡样芽孢杆菌同源性高达100%。表明该病死恒河猴感染了蜡样芽孢杆菌，引起恒河猴发生肺炎和急性肾病。

目前，条件致病菌感染越来越受到人们的重视。实验动物生活环境被污染，饲养管理方式不当，都会造成机体抵抗力下降，条件致病菌传播，从而产生巨大的经济损失。因此，我们应当重视对蜡样芽孢杆菌等一系列食源性条件致病菌，保持环境卫生，做好相关生物安全防护工作，严格卫生管理制度，以保障人和实验动物的安全。

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A diagnostic report of nephropathy caused byBacilus cereus

LI Heng ， SHE Rui-ping ， WU Qiao-xing ， SHI Rui-han ， HU Feng-jiao ， LI Wei ， ZHANG Yang

(College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

In this study，etiology，histopathology，micro pathology and molecular biology were used to study a case of bacillus cereussecondary in rhesus from a research center of Beijing.The results showed that the rhesus suffered from nephropathy，and secondary infection with bacillus cereus，leading to theeffusion pneumonia，respiratory disorders, and death.

rhesus ； bacillus cereus ； nephropathy ； amyloidosis

SHE Rui-ping

2015-09-10

李恒(1990-)，男，硕士生，研究方向为动物源性食品安全方向，E-mail：liheng1990824@qq.com

佘锐萍，E-mail：sheruiping@126.com

S852.61+6

A

0529-6005(2016)10-0096-03