梓葛冻干粉针抗脑神经血管单元炎症及氧化损伤

薛 强，肖亚平，陈玉宝，曾 杰，徐晓玉

（西南大学药学院，中医药学院，重庆北碚 400715）

梓葛冻干粉针抗脑神经血管单元炎症及氧化损伤

薛 强，肖亚平，陈玉宝，曾 杰，徐晓玉

（西南大学药学院，中医药学院，重庆北碚 400715）

梓葛冻干粉针；神经血管单元；体外模型；缺血性中风；神经保护；神经元；星形胶质细胞；脑微血管内皮细胞

由梓醇和葛根素配伍制成的抗缺血性中风新药——梓葛冻干粉针（injection of lyophilized powder with catalpol and puerarin，C-P），可透过血脑屏障并且是安全的［1－2］，可明显减少中风模型小鼠大脑梗死灶面积［3］。本研究在体外构建神经血管单元（neurovascular unit，NVU）模型并作氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤［4］，观察C-P对NVU的整体保护作用，探讨其抗炎和抗氧化机制，为C-P治疗缺血性中风提供科学依据，也为缺血性中风的治疗药物筛选提供一种多细胞体外研究模式。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级♀、♂SD大鼠购自重庆市中药研究院，合笼饲养于西南大学药学院实验动物中心。

1.2 药物和试剂 梓醇和葛根素（批号均为20111003）购自石家庄流波白鸟生物科技有限公司，纯度均≥98％；C-P由本实验室研制，批号20120613；胎牛血清、DMEM-F12培养基和B27均购自Gibco；胰蛋白酶、明胶、BSA和L-多聚赖氨酸均购自Sigma；所有抗体均购自中国中杉金桥生物技术有限公司；所有试剂盒均购自中国上海源叶生物技术有限公司。

1.3 原代细胞培养 大鼠大脑皮质微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元的培养分别参考文献方法［5－6］。

1.4 NVU模型构建及其OGD/R损伤 参考前期方法［4］，星形胶质细胞接种在插入池外侧，4 h后放入培养了2 d神经元的6孔板内；共培养2 d后，将微血管内皮细胞接种于插入池内侧，再共培养3～5 d即建成NVU模型。OGD/R损伤参考前期方法［4］并略作改进，将NVU培养基换成无糖培养液放入37℃三气培养箱缺氧4 h后，再换成含糖培养液，正常条件培养2 h。

1.5 模型损伤成功标准及分组给药 以跨内皮电阻值（TEER）明显低于正常（P＜0.05）为OGD/R损伤成功依据。实验共分5组，正常对照组细胞用培养基正常培养，损伤模型随机分为4组：OGD/R组、OGD/R＋C-P 3个剂量组（49.00、24.50和12.25 mg·L－1）。OGD/R＋C-P组分别在更换无糖培养液和复糖培养液时，两次加入C-P。

1.6 细胞形态观察 用显微镜观察不同组别中3种细胞的形态并拍照比较。

1.7 ELISA试剂盒检测蛋白含量及活性 取各组培养上清液，参照试剂盒说明书检测NO和MDA含量以及LDH和SOD活性。

1.8 Western blot检测蛋白表达 裂解并收集各组细胞裂解液，用SDS-PAGE分离蛋白，检测TNF-α、NF-κB、IL-6和IL-1β含量。

1.9 数据分析 数据用SPSS 17.0进行单因素方差分析，统计结果以±s表示。

2 结果

2.1 C-P明显减轻OGD/R对细胞的形态损伤 与正常对照组相比，OGD/R组神经元胞体明显缩小，轴突变细，轴突网络密度降低；微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体收缩并有部分脱落。与OGD/R组相比，C-P 24.50和49.00 mg· L－1组神经元胞体仅有轻微收缩，轴突及其网络无明显变化；微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体轻微收缩，无细胞脱落。

2.2 C-P明显减轻OGD/R对细胞的氧化损伤 与正常组相比，OGD/R组MDA和NO含量、LDH活性均明显增加（P ＜0.01），SOD活性明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，C-P 49.00和24.50 mg·L－1组MDA和NO含量、LDH活性均明显降低（P＜0.05），SOD活性明显升高（P＜0.05）。

2.3 C-P明显抑制促炎症细胞因子和NF-κB过表达 与正常组相比，OGD/R组NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α表达均明显增加（P＜0.01）。与OGD/R组相比，C-P 49.00和24.50 mg·L－1组该4个蛋白表达均明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

缺血性中风不仅损伤大脑神经元，神经胶质细胞和微血管也有损伤并相互影响，其病理机制涉及炎症、氧化应激、能量障碍、兴奋性氨基酸毒性等。因此，对NVU进行整体保护已成为治疗缺血性中风的重要策略［7］。本研究显示，由梓醇和葛根素配伍制成的C-P可明显改善OGD/R损伤中NVU细胞的生长形态，具有明显抗炎和抗氧化损伤作用。该研究有助于阐明C-P的多靶点和多细胞保护机制。

（致谢：感谢西南大学药学院分子药理实验室各位老师和同学的支持与帮助！）

［1］ Qin W，Mao X，Chen W，et al.HPLC-APCI-MS/MS method for the determination of catalpol in rat plasma and cerebrospinal fluid：Application to an in vivo pharmacokinetic study［J］.J Pharm Bi-omed Anal，2012，70（21）：337－43.

［2］ 原欢欢，张继芬，王 琴，等.梓葛冻干粉针的局部刺激性、过敏性、溶血性和急性毒性研究［J］.中国药理学通报，2013，29 （6）：880－1.

［2］ Yuan H H，Zhang J F，Wang Q，et al.Focal irritant，allergia，haemolyticus and acute toxicity of Catalpol and Puerarin for injec-tion［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（6）：880－1.

［3］ Liu Y，Xue Q，Li X，et al.Amelioration of stroke-induced neuro-logical deficiency by lyophilized powder of catapol and puerarin ［J］.Int J Biol Sci，2014，10（4）：448－56.

［4］ Xue Q，Liu Y，Qi H，et al.A novel brain neurovascular unit model with neurons，astrocytes and microvascular endothelial cells of rat［J］.Int J Biol Sci，2013，9（2）：174－89.

［5］ Liu Y，Xue Q，Tang Q，et al.A simple method for isolating and culturing the rat brain microvascular endothelial cells［J］.Micro-vasc Res，2013，90（6）：199－205.

［6］ Nakagawa S，Deli M A，Kawaguchi H，et al.A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells，pericytes and astrocytes［J］.Neurochem Int，2009，54（3-4）：253-63.

［7］ Lo E H，Dalkara T，Moskowitz M A.Mechanisms，challenges and opportunities in stroke［J］.Nat Rev Neurosci，2003，4（5）：399 －415.

Lyophilized powder of catalpol and puerarin re-duce stroke inflammation and oxidative stress

XUE Qiang，XIAO Ya-ping，CHEN Yu-bao，ZENG Jie，XU Xiao-yu
（College of Pharmaceutical Sciences＆College of Chinese Medi-cine，Southwest University，Beibei Chongqing 400715，China）doi：10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.028

lyophilized powder of catalpol and puerarin；neuro-vascular unit；in vitro model；ischemic stroke；neuroprotection；neurons；astrocytes；brain microvascular endothelial cells

时间：2016－2－26 10：20 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.056.html

A

1001－1978（2016）03－0442－02

R-332；R282.71；R322.81；R329.24；R743.305.31

2015－10－08，

2015－11－03

国家自然科学基金面上资助项目（No 81473549）；国家科技重大新药创制专项资助项目（No 2014ZX09304-306-04）；教育部中央高校基本科研专项资助项目（No XDJK2014D023）

薛 强（1974－），男，博士生，研究方向：中药药理学与新药研发，E-mail：xueqiang2013＠swu.edu.cn；徐晓玉（1958－），女，硕士，教授，博士生导师，研究方向：中药药理学与新药研发，通讯作者，Tel：023-68251679，E-mail：xuxiaoyu＠swu.edu.cn