不同强度不同时间耐力训练对于大鼠心肌细胞自噬发生程度的影响

马晓雯常芸王世强王菲

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

2上海体育学院

不同强度不同时间耐力训练对于大鼠心肌细胞自噬发生程度的影响

马晓雯1，2常芸1王世强2王菲1

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

2上海体育学院

目的：探讨不同强度不同时间耐力训练对大鼠心肌细胞自噬程度的影响，为运动强度和时间对心肌细胞自噬发生机制的探讨提供依据。方法：选用48只健康成年雄性SD大鼠，随机分为安静对照组、中等强度训练组和大强度训练组，每组16只。分别以15.2 m/min速度5°坡度和28 m/min速度10°坡度进行跑台训练，每周训练5天，每次训练1小时。于第8周和16周分别取各组大鼠8只进行体重称量、超声心动图检测，计算心脏重量指数（HWI）；取左心室壁用于HE染色，观察心肌组织形态；制备超薄切片进行透射电镜观察，检测自噬发生程度。结果：运动训练16周后，大强度组HWI显著低于同期对照组及同组训练8周后（P＜0.05）。超声心动图显示，训练8周后，中等强度组EF值显著高于同期对照组（P＜0.05）；训练16周后，中等强度组LVPWD、LVPWS、EF均显著高于同组训练8周后，大强度组EF值显著低于同期对照组（P＜0.05）。HE染色结果显示，大强度组心肌细胞损伤严重。透射电镜检测显示，长时间大强度耐力训练使自噬小体增多，自噬程度增加。结论：耐力训练可引起心肌组织细胞良好的适应性重塑，但大强度长时间耐力训练会导致心肌纤维形态异常，线粒体损伤聚变，自噬体增多等病理现象，构成心肌损伤的结构基础。

运动强度；心肌细胞；自噬；耐力训练

自噬（autophagosome）概念提出以来，细胞自噬在不同细胞活动中的作用引起学者广泛重视［1］。研究发现，细胞在受到营养缺乏、氧化应激、运动刺激、高温、损伤等信号刺激时，由来源不明的游离双层膜包裹衰老的蛋白质或损伤细胞器形成自噬体，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，将内容物降解为氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸，合成新的大分子和ATP，从而维持细胞稳态效益［2，3］。机体的细胞自噬一般处于一个较低的水平，但受到外界刺激时细胞自噬可能被激活。有研究显示，适度的运动可以激活细胞自噬［4］。

心肌细胞是一种高度分化的终末细胞，可通过自噬提供能量，促进物质循环以及细胞的自我更新，维持心脏功能和细胞存活［5］。正常、适度应激的心肌细胞，自噬通过降解失活蛋白质，产生氨基酸，为心肌发育、存活提供物质基础［6］，但自噬不足或过度会引起细胞功能异常［7］。

训练时间与强度对心肌细胞自噬影响鲜见报道。本研究在建立不同时间、强度训练的实验动物模型基础上，观察心肌细胞形态和自噬现象，为运动强度和时间对心肌细胞影响机制的探讨提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

8周龄SPF级健康雄性SD大鼠60只，体重为220 ±8 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXX（京）2012-0001。所有大鼠均在国家体育总局体育科学研究所ABSL-3级动物房饲养，大鼠常规分笼生活（4只/笼），饲喂标准啮齿类动物饲料（由北京维通利华生物公司提供），自由饮食，室温为22± 2℃，空气湿度为45%～55%，每天光照12小时。

1.2 分组和训练方案

适应性喂养3天后，所有大鼠进行7天适应性跑台训练，训练方案：每天15 min、速度为15 m/min、坡度为0°。适应性训练后，选取适应跑台训练的大鼠48只，随机分为3组：安静对照组、中等强度组和大强度组，每组16只。训练方案参照Bedford研究［8］：中等强度组跑台速度为15.2 m/min，坡度为5°（摄氧量约58.4%±1.7% VO2max）；大强度组跑台速度为28 m/min，坡度为10°（摄氧量约81.00%±3.5%VO2max），先以15 m/min速度跑5 min，随后在5 min内逐渐增至28 m/min，维持直至训练结束。每天14：00～17：00之间进行训练，每周训练5天，每天1小时。

1.3 超声心动图（ultrasonic cardiogram graph，UCG）测定

分别在8周和16周，每组各取大鼠8只称重，腹腔注射10%水合氯醛（40 mg/100 g体重）麻醉后仰卧位固定，胸部备皮，小动物超声探头置于大鼠左前胸，连接超声检查仪（SXTCH2.0-1005.0592）进行超声检查。测量左心室后壁舒张期厚度（LVPWD）、左心室后壁收缩期厚度（LVPWS）、射血分数（EF）。

1.4 取材与样本制备

超声心动图检测后，开胸迅速摘取心脏，经灭菌生理盐水清洗后，滤纸吸干并称重，计算心脏重量指数（心脏重量/体重）。取心尖处1 mm3小块放入固定液，用于电镜检测。切取左心室壁，经多聚甲醛固定、石蜡包埋后，于石蜡切片机切取6 μm厚的石蜡切片待用。

1.4.1 心肌组织学样本制备

将大鼠心室肌组织石蜡切片依次脱蜡、水化、苏木素染色、分化、反蓝、伊红染色、脱水、透明、封片，制成HE染色切片。置于光学显微镜下观察、采图。

1.4.2 心肌细胞形态学样本制备

大鼠左心室心尖部组织于4℃戊二醛磷酸缓冲液固定液固定24 h。常规脱水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射电镜（HITACHIH-7650）下观察心肌组织超微结构变化及自噬体的形成。

1.5 统计学分析

数据应用SPSS17.0统计软件处理，每组数据用均数±标准差（mean±SD）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用多因素方差分析法比较组间差异。

2 结果

2.1 心脏重量指数（Heart Weight Index，HWI）

由图1可见，训练16周后，大强度组HWI显著低于同期对照组及同组训练8周后（P＜0.05），中等强度组HWI略低于同期对照组，但不具有显著性差异。

2.2 大鼠超声心动图结果（表1）

8周跑台训练后，除中等强度组EF值显著高于对照组外（P＜0.05），3组间LVPWD、LVPWS、EF无显著性差异；16周跑台训练后，除大强度组EF值显著低于对照组外（P＜0.05），3组间LVPWD、LVPWS、EF无显著性差异，中等强度组LVPWD、LVPWS、EF均显著高于同组8周训练后（P＜0.05），大强度组、对照组LVPWD、LVPWS、EF与同组训练8周后相比无显著变化。

2.3 心肌组织的形态（图3）

无论训练8周还是16周后，对照组心肌细胞均排列整齐、横纹清晰、细胞外间质较少；中等强度组训练8周后心肌细胞排列整齐，细胞间隙正常，横纹清晰，而16周后，心肌细胞体积稍增大，横纹消失，细胞间隙变宽，部分肌纤维断裂；大强度组训练8周和16周后心肌细胞均肥大、排列紊乱、细胞核增大、细胞间隙增大、横纹消失、肌纤维断裂，且16周肌纤维受损更为严重。

2.4 心肌细胞的形态（图4、图5）

8周的训练后，对照组心肌细胞排列整齐、明暗带清晰、Z线完整、闰盘连接紧密、可见桥粒；中等强度组心肌细胞排列稍紊乱、线粒体代偿性增生、偶见双层膜结构；大强度组肌纤维断裂缺失、线粒体增多聚集、形态变异、线粒体嵴消失、电子密度增加、双层膜结构聚集增加、自噬程度增强。16周后各组变化趋势与8周相同，中等强度组线粒体增生程度比8周高，自噬水平无显著性差异；大强度组心肌细胞膜局部缺失，线粒体聚变，嵴断裂，电子密度增高，自噬体增多，自噬程度更强（图5箭头所指处）。

3 讨论

3.1 不同强度不同时间训练后心脏大体结构与功能的改变

HWI是评价左心功能不全严重程度较有价值的指标，比单纯的体重更能反映心脏功能的改变［9］。本研究发现，大鼠经过16周大强度训练后，HWI不仅显著低于对照组，也显著低于其训练8周后（P＜0.05）。提示长时期大强度运动可能导致心脏供血功能下降。

UCG是临床检测心功能最常用的无创性技术，通过UCG中的LVPWD、LVPWS、EF，可以定量检测心脏结构功能状态［10］。

8周跑台训练后，不同强度组LVPWD、LVPWS无显著性差异，表明8周的训练时间太短，不足以引起心脏结构重塑、改变心脏供血能力；中等强度组EF值显著高于对照组。Babette等［11］研究发现，长期运动训练导致运动员心脏做功效率高，功能储备强，一般安静时EF较普通人大，这与本实验结果一致。原因可能是中等强度运动对大鼠左心室供血能力改善属于适宜刺激强度，8周的中等跑台训练增强了左心室射血能力，保障肌体供血充足。16周大强度跑台训练后，EF值显著低于对照组，可能与长时间大强度的训练造成心肌组织细胞结构损伤有关，导致心肌射血功能下降。

运动员心脏的特征主要表现在形态与机能两个方面，其中，运动性心脏肥大是运动员心脏主要形态变化，以左心室肥大为主，其肥大程度与运动强度和运动持续时间呈正相关［12］。本研究大鼠进行中等强度训练，16周后LVPWD、LVPWS和EF值显著高于8周，提示伴随着中等强度训练时间的延长，左心室壁厚度增加，心肌功能得到进一步改善，这与运动心脏的基本改变一致［12］。

3.2 不同强度不同时间训练后心肌细胞形态的改变

本研究对左心室壁进行HE染色，经过16周训练，对照组心肌细胞排列整齐致密、结构清晰、细胞外间质较少；中等强度组心肌细胞排列稍紊乱、细胞间隙微量增大、横纹模糊、有少量的肌纤维缺失；大强度组心肌细胞肥大、排列紊乱、细胞间隙增大、肌纤维断裂。这与李奕等［13］研究大鼠经过7周的递增负荷训练后心肌纤维形态的结果相似。

中等强度训练8周后心肌细胞排列整齐、细胞间隙正常、横纹清晰，16周后心肌细胞肥大、间隙变宽、部分肌纤维断裂或溶解。大强度训练8周后组织中存在少量空泡且细胞排列间隙增大，16周后出现红细胞渗出现象、细胞核浅且不清楚，提示大鼠心肌出现了损伤。这可能是因为长期的大强度的训练造成心肌反复缺血缺氧，导致心肌细胞发生病理性改变。刘泽广等［14］类似的比较研究也指出运动组大鼠心肌纤维可见形态异常，着色不均匀，细胞边界模糊不清，细胞排列不整齐。

3.3 不同强度不同时间训练后心肌细胞形态与自噬发生程度改变

细胞自噬属于II型程序性细胞死亡，以自噬小体的形式呈现，溶酶体消化并形成自噬体，为其他细胞的生存与发育提供营养物质。细胞自噬作为细胞内的主要降解途径，不仅清除代谢废物，还作为一种动力循环系统，生成细胞更新和动态平衡所需的能量和物质［15］。大量研究结果已证实细胞自噬是心肌对抗损伤、缓解细胞死亡的一种重要调节方式［16］，心肌细胞分化再生能力非常有限，自噬对于维持心脏功能和活力具有重要的作用［17］。适宜强度的运动训练可通过提高细胞自噬的激活而预防或缓解各种心脏疾病［18］。目前，应用透射电镜动态观察自噬体的形成是检测自噬发生的金标准［19］。因此，本研究利用透射电镜观察不同训练强度、时间大鼠心肌超微结构，发现：

8周的训练后，对照组心肌细胞排列整齐致密、结构清晰、闰盘连续、桥粒连接可见；中等强度组心肌细胞排列稍紊乱、有少量的肌纤维缺失、线粒体代偿性增生、偶见自噬体双层膜结构；大强度组细胞膜破裂溶解、肌纤维紊乱、肌丝缺失、线粒体代偿性增生、线粒体嵴消失、自噬体呈团分布。16周后各组呈现与8周相同的变化趋势。适宜强度的运动训练可以上调细胞自噬水平，从而降解细胞内的代谢废物，维持细胞自身稳态［20］。本研究大强度组自噬程度的变化趋势与Campos［21］研究结果基本一致，可能是过量的大强度运动使机体自由基生成增多，线粒体氧化磷酸化水平降低，线粒体代偿性增加，引起过度自噬，从而损害心肌结构及心脏功能。

中等强度训练8周后心肌细胞排列整齐、肌小节完整、Z线清晰，16周后细胞结构破坏，线粒体大量增生，部分肌纤维断裂或溶解，自噬体聚集出现。大强度训练16周后大鼠心肌细胞膜局部缺失、线粒体聚变、嵴断裂、电子密度增高、线粒体被细胞膜包裹形成双层膜结构、形成自噬体增多。贾绍辉等［22］研究发现，短期运动在导致细胞凋亡的同时可以激活心肌细胞的自噬，长期运动会降低心肌细胞凋亡，增强自噬的激活。透射电镜观察发现与对照组相比，中等强度长期训练能有效地提高心肌线粒体数量与质量，减少衰老或受损线粒体的数量，满足运动时心输出量的要求，形成运动性心脏重塑［23］，增强了心肌功能，有利于心脏供血供氧。

4 结论

中等强度耐力训练可引起心肌组织细胞良好的适应性重塑，促进细胞自噬，增加心肌收缩功能，对于心肌纤维起到一定保护作用。但是大强度长时间耐力训练可以导致心肌纤维排列紊乱、断裂，线粒体损伤、聚变，自噬体形成增多，构成心肌损伤发生的病理基础。实验观察到训练时间和训练强度可以影响心肌细胞自噬的发生过程，但是对于心肌细胞自噬发生的机制，我们将后续研究报道。

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Effects of Endurance Training on the Cardiomyocyte Autophagy in Rats

Ma Xiaowen1，2，Chang Yun1，Wang Shiqiang2，Wang Fei1
1 China Institute of Sport Science，Beijing，China 100061
2 Shanghai University of Sport，Shanghai，China 200438

Chang Yun，Email：changyun@ciss.cn

Objective To investigate the effects of endurance training with different intensity and duration on the cardiomyocyte autophagy of rats.Methods 48 SD rats were randomly divided into sedentary control group，moderate intensity exercise group and high intensity exercise group.Rats in the two exercise groups performed treadmill training 5 days per week，1 hour per day respectively for 8 weeks and 16 weeks at the speed and slope of 15.2m/min and 5°.The echocardiography was carried out for the rats respectively after 8 and 16 weeks of experiment and the heart weight index（HWI）was calculated according to echocardiogram and body weight.The histology of left ventricular wall was observed microscopically and the level of autophagy was determined by transmission electron microscope.Results The HWI in high intensity exercise group after 16 weeks of training was significantly lower than in sedentary control group（P＜0.05）and high intensity exercise group after 8 weeks of training（P＜0.05）.The LVPWD，LVPWS and EF in moderate intensity exercise group after 16 weeks of training were significantly greater than that in moderate intensity exercise group after 8 weeks of training，and in moderate intensity exercise group after 8 weeks of training were significantly greater than that in sedentary control group（P＜0.05）.The LVPWD，LVPWS and EF in high intensity exercise groupafter 16 weeks of training were significantly smaller than that in sedentary control group（P＜0.05）.The degree of autophagy exacerbated with the increasing of duration and intensity of endurance training.Conclusion Though the endurance training can well remodel the myocardial structure，however，long-term high intensity endurance training can cause the appearance of abnormal myocardial fiber and mitochondrial damaging fusion，and increase in level of autophagy.

endurance exercise，intensity，duration，myocardial autophagy

2015.04.03

国家体育总局体育科学研究所基本科研业务经费资助项目（14-01）

常芸，Email：changyun@ciss.cn