波形蛋白在细胞内外的不同功能与相关病理①



波形蛋白在细胞内外的不同功能与相关病理①

陈卓方成

(武汉轻工大学医学院移植免疫实验室，武汉430023)

真核细胞骨架是由微管、微丝、中间丝(Intermediate filaments，IFs)构成的蛋白纤维网状支架系统。IFs根据基因序列分为六种类型，不同类型中间丝的表达具有明显的组织细胞特异性。波形蛋白(Vimentin，Vim)为Ⅲ型中间丝蛋白，主要表达于中胚层起源的间充质细胞中，如成纤维细胞、内皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等。Vim在感染、肿瘤、自身免疫、固有免疫等多方面显现复杂的功能特性。

1Vim的结构

Vim基因在不同脊椎动物中序列高度保守。人Vim基因位于染色体10p13上，含9个外显子，开放读码框架1 401 bp。Vim单体由466个氨基酸残基组成为丝状纤维分子，相对分子质量约为53 kD。

Vim单体由头部非螺旋氨基(N)末端(103个氨基酸)、尾部非螺旋羧基(C)末端(55个氨基酸)和中间的杆状主域(308个氨基酸)构成。中间杆状结构域的四段高度保守的α螺旋(1A、1B、2A、2B)由三个连接区域(L1、L12、L2)连接形成两个卷曲的超螺旋结构。N端和C端结构域的氨基序列具有高度多态性，都存在含磷酸化靶点的高度伸展结构域。磷酸化修饰为Vim形成复杂结构、产生不同功能提供动力，也使Vim能够参与信号传导[1]。

每两个Vim单体分子平行排列形成1个超螺旋二聚体，每两个二聚体反向平行形成没有极性的四聚体，多个四聚体首尾相连构成一根原纤维，每8根原纤维平行并联成1根直径10 nm的中空圆柱状Vim纤维。免疫荧光标记Vim纤维，可观察到在胞内有长纤维、短纤维和非纤维颗粒形态[2]。Vim单体在体内、外均可自行迅速聚合成Vim纤维，此过程不需要ATP或者GTP，仅受离子强度的影响。但若desmin(结蛋白)存在，Vim单体更易与desmin单体聚合成异聚体纤维。Vim的同源多聚体与异聚体纤维为其在胞内常有的两种形式。Vim纤维依赖磷酸化/去磷酸化调控聚合/解聚的动态平衡，此平衡受Ⅲ型IFs结合蛋白网格蛋白(Calthrin)调控。

2Vim胞内功能与相关病理

免疫荧光标记显示真核细胞内Vim呈放射性波浪状细丝，与细胞核膜、细胞器、细胞膜连接，以维持胞内完整的亚细胞结构及细胞的正常形态。目前相关研究发现Vim与肿瘤、感染、炎症发展、固有免疫等有密切关系，这些病理状态的形成与Vim在真核细胞分化、黏附、移行、信号传导和凋亡等功能中起到的重要作用密不可分。

2.1细胞骨架功能与凋亡正常成纤维细胞为梭形细胞，具有典型的肌动蛋白(Actin)细胞骨架和Vim细胞骨架，并且成纤维细胞特异性蛋白(Fibroblast-specific protein 1，FSP1)正常表达。靶向破坏Vim细胞骨架后发现，成纤维细胞形态发生明显改变，由典型的间中质梭形向球形转变，FSP1表达下调，actin网络结构也明显改变[3]。 Vim KO小鼠内皮细胞核形态也有内陷、褶皱现象。Vim降解或突变诱发Caspase凋亡信号促使细胞凋亡。激活的Caspase家族进一步降解Vim成碎片和颗粒物聚集在细胞核周围，同时Vim与细胞核的联系完全或部分消失引起细胞核凝集及核碎片化，细胞表现出变圆或细胞质收缩等凋亡特有形态。这些碎片又进一步促进Caspase活化，引起凋亡信号的级联放大。Lahat等[4]发现WFA(Vim特异抑制剂)环氧基团与Vim半胱氨酸残基高度特异性结合，诱导Vim降解，明显抑制组织肉瘤和有上皮性-间质表型肿瘤的生长和复发。Rodriguez等[5]发现Vim会随着PARP1(基因组功能相关蛋白酶)下调而解聚，诱导凋亡发生，抑制黑色素瘤细胞的生长和复发。

2.2调节细胞黏附、迁移功能与间充质化在细胞黏附功能中整合素家族起关键作用，其胞内段能招募如网蛋白、黏着蛋白和Vim等细胞骨架蛋白，然后向细胞内部转导信号及产生黏附有关的生理功能。Vim调节细胞黏附可能有2种途径。一是Vim识别整合素和黏附分子，形成胞外的锚定结构(桥粒和半桥粒)，以维持细胞间的锚定衔接。如在内皮细胞中Vim与整合素αVβ3直接结合形成FAS(黏着斑)，以维持细胞的黏附状态及黏附倾向性[6]。纤维母细胞的FAS通过网蛋白1f(Plectin isoform 1f，P1f)与Vim结合后，使Vim纤维丝形成笼状结构围绕于细胞核周围，加强了细胞与胞外基质的连接，该结构对维持细胞的形态、极性和细胞间的黏附具有重要作用[7]。二是胞浆中Vim结合囊泡形式的Integrin-β1(整合素β1)，囊泡上的PKCs途径使结合其上的Vim头部磷酸化，整个结合体到达胞膜上特定部位后依赖PKCs途径去磷酸化释放囊泡至胞膜表面，Vim重新进入胞浆再次运输Integrin-β1。这种PKCs依赖的Vim磷酸化/去磷酸化过程，对调控整合素黏着斑、调控黏附位点大小、稳定内皮细胞必不可少[8]。有研究证实Vim敲除后会抑制HEK-293和3T3细胞在胶原中的迁移和延伸，且细胞黏附能力、Integrin-β1的表达及其激活都下降了50%以上[9]。

上皮细胞-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。Vim是此过程中间质细胞的标志物。EMT过程中，Vim在上皮细胞高度表达，角蛋白骨架转化为Vim细胞骨架，上皮细胞转变成为间质细胞，细胞极性消失、黏附能力减弱、运动能力增强。

Ⅱ型EMT包括损伤修复、组织再生和器官纤维化相关的EMT。通过纤维细胞的产生以修复由创伤和炎症反应造成的组织损伤。当炎症反应缓解后该转化过程即自行停止。然而炎症反应持续活化，Ⅱ型EMT过程也将持续存在，最终造成器官纤维化。Menko等[10]发现当人眼晶状体受到损伤，损伤边缘的某些晶状体上皮细胞(修复祖细胞)会转变成修复细胞。Vim大量表达于修复细胞的伪足处使得修复细胞快速迁移和扩散，修复损伤边缘。并首次发现Vim通过与myosinⅡB结合调节修复细胞迁移及损伤修复的能力。

Ⅲ型EMT是指与上皮细胞恶性肿瘤相关的表型转化。原发性上皮组织肿瘤细胞通过Ⅲ型EMT形成具有迁移能力的间充质细胞，随血流转移至不同部位，再通过MET(间质细胞-上皮化)过程形成上皮细胞的肿瘤转移灶。Rodriguez等[5]发现Vim的高表达能诱导黑色素瘤细胞的促转移表型增加，包括：ILK(整合素连接激酶)/GSK3-β依赖的E-钙黏素(内皮正常细胞的标志物)下调，Snail1的激活，增加了细胞的迁移力，促进EMT的发生。丁隆等[11]研究miR-22基因对肝癌细胞表型转化的作用发现，miR-22调控肿瘤细胞表型转化成间质型细胞时，Vim表达量上调。

2.3协同蛋白功能与免疫CD病(胃肠道慢性肉芽肿)是宿主对AIEC(黏黏-侵袭性大肠杆菌)的固有免疫应答缺陷导致的。Stevens等[12]发现Vim是NOD2的协同蛋白。NOD2的LRR(富含亮氨酸重复单位)区内功能性组件L1007fs、R702W、G908R与Vim相关位点结合，才能识别AIEC的MDP(胞壁酰二聚糖)，从而激活NF-κB通路，启动细胞自噬并杀灭AIEC。胞浆中的模式识别受体NOD2的基因突变，是导致CD病的唯一因素。CD病相关的基因多态性，使L1007fs、R702W不能定位与Vim的结合，出现免疫应答缺陷。

Tolstonog等[13]发现Vim KO小鼠胚胎成纤维细胞中，线粒体呼吸链的氧化磷酸化偶联过程比正常细胞弱，细胞核及核周区域中大量积聚ROS(活性氧簇)，导致氧化性损伤。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的，包括：O2-、H2O2及HO2-、OH-等。高浓度的ROS可通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。Mor-Vaknin等[14]发现，在肠道上皮细胞内Vim与Nox(NADPH氧化酶)的活性亚单位p47phox 结合使Nox处于抑制状态，Nox是产生ROS的主要酶体，故而ROS处于低水平。腹腔注射大肠杆菌感染Vim KO小鼠能够比WT(野生型)小鼠更好的控制细菌感染。同时体外实验揭示Vim KO的BMM(骨髓来源传代巨噬细胞)能够产生大量的ROS介导杀灭细菌，杀菌能力显著增强。提示Vim作为Nox的协同蛋白，调节巨噬细胞产生ROS的能力。Ise等[15]发现吞噬细胞表面的Vim与凋亡细胞中的配体N-乙酰氨基葡萄糖激酶(O-GlcNAc)结合，刺激丝氨酸第71位点发生磷酸化，参与对凋亡细胞的包裹与清除。

2.4受体功能与感染PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)主要侵害猪的巨噬细胞系统，引发免疫缺陷，从而导致如间质性肺炎、淋巴结坏死、病毒血症、脑炎等疾病。马晓春等[16]证实Vim及其多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145易感细胞系。重组波形蛋白转导到PRRSV非易感细胞系PK-15中使之获得了易感性，证实Vim是PRRSV受体复合物的一部分。

Garg等[17]发现被结核分枝杆菌感染的细胞表面大量表达Vim，Vim能与NK细胞表面的NKp46受体结合，使感染的细胞死亡，以对抗细菌感染。Chi等[18]用人脑微血管上皮细胞证实Vim是IbeA1(大肠杆菌侵袭素)调节的E.coli(大肠杆菌)K1-信号传导的受体。这个菌株诱发新生儿细菌性脑膜炎。

Kanlaya等[19]发现Vim在登革病毒(Dengue virus，DV)感染后与核糖核蛋白(hnRNP)及病毒NS1蛋白相互作用形成复合体，用丙烯酰胺破坏Vim后该复合体不能形成，病毒NS1蛋白也表达下调，病毒的复制和释放量显著下降。提示Vim在DV的复制及释放中发挥着重要作用。

3Vim胞外功能与相关病理

3.1自身抗原特性与自身免疫凋亡的巨噬细胞中Vim经过肽基精氨酸脱亚胺酶(Peptidyl-arginine deiminase，PAD)瓜氨酸化形成的cVim(瓜氨酸化波形蛋白)，是RA(类风湿性关节炎)的主要抗原之一。其自身抗体(抗-Sa，抗-MCV)是ACPA(抗瓜氨酸化抗体)中的主要高度特异性抗体，是早期RA严重程度的重要指标。含大量cVim的ICs(抗原抗体复合物)特异性地存在于关节滑膜中，刺激FLS(成纤维样滑膜细胞)分泌各种蛋白酶类、花生四烯酸代谢产物及细胞因子，促进关节损伤。宗明等[20]发现cVim增加DC的抗原提呈作用，能在局部诱发T细胞介导的免疫反应，调节炎症因子如IL-10、IL-12的分泌，为cVim诱导RA发生提供新证据。Carrier等[21]发现cVim可与HLA-DR(MHC Ⅱ型类分子)结合，提示cVim参与介导炎症持续，也可能为RA 发生的机制之一。

ARF(急性风湿热)是由异常免疫反应引起的多系统自身免疫疾病，GAS(甲类链球菌)咽炎倾向的人群多发。ARF反复发作病例中30%～50%的患者伴有慢性心脏瓣膜损伤。抗链球菌A型抗体和AECA(抗内皮细胞抗体)是风湿性心脏病(RHD)的标志物。Delunardo等[22]发现链球菌-Vim交叉反应性抗体诱发RHD。链球菌产生的HSP70和SRRP1蛋白与心脏内皮细胞Vim的α螺旋结构域有两个相同的结构域，交叉反应性抗体攻击内皮细胞Vim从而造成损伤，激活IRAK1(白细胞介素1受体相关激酶)和NF-κB，使促炎因子和GF(生长因子)表达及释放。

前期体内实验研究发现慢性移植肾病(CAN)受体Vim反应性T细胞和抗Vim抗体的数量急剧升高[23]。Rose[24]研究发现，B细胞缺陷的小鼠同种异体心脏移植后，过继转移含AVA(Vim自身抗体)的血清即引起超急性排斥反应，提示Vim自身抗体能强化免疫损害。

3.2细胞因子特性与固有免疫Gharbi等[25]发现PGA1(抗炎制剂)能够靶向修饰Vim的第328位的半胱氨酸残基，使Vim蛋白功能发生缺失，从而发挥抗炎作用。

Bargagna-Mohan等[26]首次发现Vim在GFS(青光眼滤过手术)纤维化模型中的药理作用。可溶性Vim可上调E3泛素连接酶skp2的表达，抑制p27kip1蛋白酶降解，促进p27kip1的降解。而p27kip1具有抑制细胞增殖，保护组织和细胞免受炎症损伤的作用。从而证实Vim可依赖Skp2- p27kip1通路产生促炎效应，并促进纤维化发生。而WFA对Vim有浓度依赖性的特异性抑制作用，能阻止GFS术后的纤维化。

前期的体外实验也发现Vim剂量依赖性地刺激淋巴细胞增殖，且对预致敏或未致敏淋巴细胞的增殖效应无显著差异，提示Vim具有非特异性免疫活化功能。

Mor-Vaknin 等[27]证实激活的人巨噬细胞能分泌波形蛋白到细胞外。这种分泌受促炎信号通道调节，TNF-α刺激信号增强，IL-10则反之。Thiagarajan等[28]进一步证实MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)促进单核细胞释放Vim，提示Vim参与固有免疫应答。

Thiagarajan等[28]观察到非Toll样模式识别受体Dectin-1(人树突状细胞源性C型凝集素样受体-1)与分泌型磷酸化Vim的直接结合，提示Vim为Dectin-1的内源性配体。并进一步证实炎症动脉壁的MDM(单核来源的巨噬细胞)分泌磷酸化Vim到胞外，刺激Dectin-1并激活MDM的Nox产生大量的NADPH O2-，使募集到胞内的LDL(低密度脂蛋白)氧化，最终形成动脉粥样硬化特征性的泡沫细胞和脂质沉积。

4结语

综上所述，Vim作为Ⅲ型IFs蛋白，有复杂的功能特征。在细胞内Vim参与了细胞分化、黏附、移行、信号传导和凋亡等功能。而在细胞外，RA、RHD、CAN及动脉粥样硬化等慢性炎症疾病的研究发现 Vim与自身免疫、固有免疫有较多的联系。对于Vim在免疫反应、炎症及慢性纤维化的交互过程中发挥的作用及具体机制有待阐明和揭示。对Vim的研究会为此类疾病的治疗提供新的理论基础。

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[收稿2015-04-20修回2015-06-01]

(编辑倪鹏)

中图分类号R392.32

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0436-04

作者简介：陈卓(1990年-)，女，主要从事免疫药理学研究，E-mail:chenzhuoc@sina.com。通讯作者及指导教师：方成(1972年-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事免疫生物学和免疫药理学研究，E-mail:fang_cheng@foxmail.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.032

①本文受湖北省教育厅科研计划项目(Q20121808)、国家自然科学基金项目(31370867)资助。