主动免疫：预防蓖麻毒素、相思子毒素中毒①

王俊虹　徐忠伟　魏茂提

(武警后勤学院，天津300309)



主动免疫：预防蓖麻毒素、相思子毒素中毒①

王俊虹②徐忠伟魏茂提②

(武警后勤学院，天津300309)

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)和相思子毒素(Abrin toxin，AT)都属于大分子植物来源的蛋白毒素，属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins，RIP)，能够抑制细胞蛋白合成而具有极强的细胞毒性。由于来源广、毒性强等特点，二者均被认为是重要的致死性生物毒素战剂，美国疾病控制中心(CDC)定义为B级生物威胁[1]。因此，开展对RT和AT的生防疫苗的研究，对提高军队和国家应对生物战和生物恐怖的能力和水平，增强生防能力和保障国家安全，具有非常重要的军事意义和社会意义。

1　毒素的基本特性

RT和AT在毒素来源与制备、分子结构和作用机制方面非常相似，分子量约为60～65 kD，由A、B两条多肽链通过二硫键相连接。毒素A链的分子量约为29 kD，具有RNA N-糖苷酶活性，能够使核糖体失活而抑制蛋白质合成，是效应链；毒素B链的分子量约为32 kD，帮助A链发挥毒性作用，为结合链[2]。

其中，RT是从蓖麻籽(Ricinus communis)中提取的植物糖蛋白。RTA由263个氨基酸残基组成，第10个残基Asn已糖基化，只有两个Ly残基，对A链的毒性作用至关重要。RTB则由259个氨基酸残基组成，含两个寡糖链。RT的毒性强，LD50依据暴露途径不同而异，全毒素在小鼠、兔、猴子的致死剂量为5～25 μg/kg，吸入方式的LD50为3～17 μg/kg，摄入方式的LD50为20 mg/kg。估计的人类致死剂量为吸入或注射方式1～25 μg/kg，摄入方式20 mg/kg。当单独的RTA肠道外给药小鼠时，毒性大大降低，仅为全毒素的1/1 000[2]。

AT来源于植物相思子(Abrus precatorius)的种子，是一种剧毒性高分子植物蛋白毒素，是毒性最强的植物毒素[3]。全毒素经二巯基乙醇处理后A、B两条链分离开，其中A链(ATA)与RTA链存在102个相同的氨基酸残基。B链(ATB)由267个或268个氨基酸残基组成，在一级结构上的位置为Asn51和Asn260，毒素所含的糖基主要存在于B链上。天然AT有a、b、c、d四种亚型，a亚型的细胞毒性最强，而b、c较弱，推测可能是由于其B链凝集活性低导致。虽然AT在结构特性方面与RT非常相似，但毒性比RT高出70多倍，小鼠腹腔LD50约为0.04 μg/kg，成年人的致死剂量为5.0～7.0 μg/kg，因此一旦被恐怖分子所利用，其造成的危害必将更加严重。

2　疫苗的研究进展

RT和AT作为潜在的生物恐怖战剂之一，发展有效的防治手段已成为各国生防领域的重要研究任务，也取得了一定的进展。美军传染病医学研究所(USAMRIID)一直致力于毒素预防措施的研究，从19世纪80年代就提出应基于不同人群需要建立相应的预防方法，即民用方式和军用方式[4]。在民用方面，个体暴露的危险虽低但却极易造成骚乱，因此以暴露后的治疗为主。在军用方面情况则不同，由于毒素攻击以群体形式存在，临床症状又依赖于暴露途径(主要经污染的食物、水和空气，以气溶胶状态的毒素暴露最为严重)，因此应采用各种预防措施，包括物理防护、化学解毒剂和免疫接种[5]，其中又以疫苗的研制为主。理想的疫苗应该能保护个体免受各种途径的RT和AT攻击，特别是黏膜途径，因为这是毒素攻击的最佳途径。同时疫苗应保存时间较长且在1或2次接种后即有较长时间的保护效力。根据RT和AT的分子结构特点，我们将疫苗研制分为全毒素疫苗，基于A链蛋白的疫苗和基于B链蛋白的疫苗。

2.1全毒素疫苗

2.1.1类毒素由于RT和AT的免疫反应主要由抗体介导，因此最简单直接的方法是采用亚致死剂量的毒素免疫小鼠，诱导出高效价的IgG抗体，以抵挡经静脉、皮下、腹膜方式的致死剂量天然毒素攻毒。或通过加热或化学方法使毒素不可逆地失去毒性，同时保留毒性的关键表位以保持免疫原性。其中RT类毒素以啮齿类动物为模型进行了大量的研究[6]，接种方式包括经皮下、鼻内、气管内、口服注射以及以各种脂质体的形式进行黏膜免疫等。早在18世纪90年代，研究人员就通过口服类毒素免疫小鼠以抵抗皮下注射方式的致死剂量天然毒素攻击。到了19世纪40年代，美军采用福尔马林失活的全毒素免疫动物，但是这种疫苗没有进行到临床前研究阶段[3,6]。由于吸入方式为毒素的主要生物恐怖方式，疫苗免疫的重点应集中在呼吸系统的保护。动物实验表明鼻内或气管内注射类毒素能有效地诱发全身免疫，保护致死剂量的气溶胶毒素攻毒，然而该类疫苗虽然具有免疫原性，但却不能有效刺激局部免疫反应，从而不能阻挡毒素经气溶胶或气管内暴露途径所造成的肺损伤。实验结果表明分泌性抗体对保护气溶胶状毒素导致的肺损伤很重要，可以通过被动免疫气溶胶化的多种多抗血清的鸡尾酒疗法，或通过黏膜免疫刺激分泌性抗体，但保护时间会相对缩短，从而并不可行。

由此可见，虽然RT类毒素单独口服给药能刺激长期的体液免疫并最终保护动物免受致死剂量的毒素攻击(至少在啮齿类动物模型上得到证实)，而且由于它包含了RTA和RTB两个亚单位，均能刺激相应的中和抗体。但是它仅能对吸入性暴露给予最低的保护，类毒素还残存部分毒性，技术上很难完全失活，在一定条件下还能恢复至活性毒素，因此不太可能作为安全的候选疫苗。此外，完全失活的类毒素也几乎没有免疫原性(至少在啮齿类动物)，这就需要佐剂或脂质体等载体。为了增进局部呼吸道的免疫性，类毒素以脂质体微囊化的方式进行传递，结果表明可以同时减少抗原使用量和接种次数。这类疫苗通过气管途径免疫接种兔，可保护其免受RT致死剂量的攻击[4,6]。脂质体包裹的类毒素可诱导分泌型IgA(sIgA)高达28.7%，可有效地减轻肺部损害。同样的，这种单一剂量的类毒素也可通过鼻内接种，能提供至少1年的全身免疫和局部免疫，因此不必进行复杂的接种，也减少了引发有效免疫所需的时间。以上实验结果说明胶囊化的类毒素可作为候选口服疫苗。

同样的，经甲醛化处理形成的AT类毒素，虽然能有效保护动物而对抗相应的毒素中毒[7]，但与RT类毒素一样，无法避免残留毒性这一缺点而未有进一步的发展。4,6由此可见，针对类毒素的疫苗研制近年来主要集中以脂质体微囊化的方式传递类毒素。同时，研究者发现，作为疫苗，A链亚单位并不如类毒素的效果好[3,6,7]，至于原因，作者并不清楚是否因为类毒素比A链具有更为宽广的免疫应答反应(例如可抗B链亚单位)。

2.1.2抗独特型抗体(AB2β)[8]AB2β可以识别抗体上与抗原互补的决定簇从而完全抑制抗原与独特型的结合，具有类似抗原的结构，是外界抗原的内影像，能诱导不同种属个体产生特异性免疫应答。抗RT单克隆抗体可被动保护同系小鼠抵抗蓖麻毒素的袭击，用此单抗免疫家兔制备抗独特型抗体，并加氢氧化铝佐剂免疫的小鼠可抵抗致死剂量RT的攻毒。

2.1.3RT-MPP这种疫苗的研制基于植物中发现的同源性蛋白前体，由于有一个氨基酸插入其中而干扰了活性位点，翻译后切除掉这段序列后才表现活性。RT-MPP则是在RT序列中插入一个25个氨基酸残基的多肽以消除酶活性位点，可大大降低其催化活性，如直接切割肽的插入则可有效恢复A链的催化活性。该疫苗对培养的哺乳动物细胞没有毒性，免疫大鼠可完全抵抗致死剂量天然毒素的攻击，免疫兔后可以抵挡气管途径的毒素攻击。但是，疫苗残存的催化活性使其不可能成为适合于人类的候选疫苗[4]。

2.2基于A链蛋白的疫苗

2.2.1去糖基化后的RTA(deglycosylated RTA,dgRTA)[3,6]dgRTA的设计思路是使RTA在保持免疫原性表位的同时消除细胞毒活性以便诱导保护性中和抗体，从而阻止肝脏的吸收而减少肝损伤。实验结果表明该疫苗可以诱导良好的黏膜免疫，特别是提供黏膜途径(即气溶胶化RT)攻毒的保护。但是，其引起的全身系统的免疫却并不如类毒素。为此，研究者以微囊脂质体的形式使dgRTA进入呼吸系统。但是在安全性方面，dgRTA虽然比类毒素的毒性小，但仍可引起局部甚至全身的血管渗透综合征(Vascular leak syndrome,VLS)，原因是在体外实验中虽然比天然毒素毒性小，但它在血液中的半衰期延长而导致在体内致死性大大提高。此外，dgRNA生产较难并造价昂贵，并不适合大规模生产，目前dgRTA的方法已被放弃。

2.2.2RVEc(RTA1-33/44-198)[9，10]虽然单独的RTA可以保护动物抵抗RT的攻击，但是RTA的RIP活性具有毒性且在缺失RTB时，暴露出的RTA疏水表面很容易聚集的趋势而限制了疫苗方面的使用，而活性位点的置换被认为是一种可以失活RTA并能安全作为疫苗的手段，因此研究者以RTA结构为基础，通过逆向进化选择，采用基因工程方法消除RTA的整个疏水基团，获得了一个非功能性的单域结合框架(RTA1-198)，使其将RTA特异性保护表位(RTA环95-110)呈现到框架表面，以这种模建方式构建了蛋白质RVEc(RTA1-33/44-198)。RVEc虽然保留了肺血管渗透综合征(VLP)序列，但并不会引起免疫动物的体重减轻或其他血管渗漏综合征。

虽然被切除的部分可能包含有目前尚未发现的重要保护性表位，但疫苗分子仍保有已知的重要免疫原性多肽。无论是否添加佐剂，该疫苗均可抵抗(5～10)×LD50注射或气溶胶状态天然毒素的攻击，小剂量如1.25 μg/小鼠能保护5×LD50气溶胶RT攻击，而20 μg/小鼠再联合佐剂则能保护30×LD50气溶胶RT攻击。用兔进行临床前的毒理学试验中表现良好的免疫性和无毒性，在非人类的灵长类动物中也同样有效。该疫苗很稳定，毒性与RTA相比至少降低了3个数量级，在没有稳定剂的情况下可以反复冻融。当配方由磷酸盐缓冲液再融于琥珀酸盐缓冲液则能够提高与氢氧化铝佐剂的结合力，在小鼠模型中可以提高抗原性3倍。该疫苗的研制已进展到临床前研究，包括在新西兰白兔进行毒性试验，结果证明未检测到VLS症状或RIP活性。2011年开始Ⅰ期临床试验，已经进行多剂量连续给药和单中心研究。只是到目前为止，疫苗保护气溶胶毒素攻击导致的肺功能数据未见报道。

2.2.3RiVaX[5,11]RiVax的研究思路与RVEc相似，均是基于RTA分子进行基因改造以减轻或消除酶活性而成为候选疫苗。据文献报道，A链中的Y80、Y123、E177、R180、N209、W211构成了酶活性，L74、D75和V76可引起在重度复合性免疫缺陷病等。因此考虑以上两种因素后经筛选构建的突变体疫苗Y80A/V76M即RiVax，晶体结构非常接近野生型RTA，主要的构象决定簇完整。在不使用佐剂的情况下，可以抵抗经腹腔摄入的10×LD50的天然毒素的攻击，显现出良好的免疫效果。肌肉注射小鼠可以保护口服、注射、吸入性途径的毒素攻击。与肌肉注射相比，经真皮免疫能提高保护性抗体的效价。当大规模人群需要免疫时，该免疫途径是最佳选择。在气溶胶模式，暴露后的周期肺功能试验和组织学实验表明该疫苗能保护小鼠的肺组织免受损伤。以上的实验结果很重要，因为合格的疫苗应该保护机体免受各种微小损害(即使是可逆性的)，这也是RiVax区别于其他疫苗的最大优点。在志愿者进行了一系列的临床试验，实验结果良好，第二批使用佐剂的试验还在进行中。同时，该疫苗性质稳定，储存方便，可以在-20℃或冻干保存在4℃或25℃以供临床应用。这一优点使RiVax同样适用于军队，目前该疫苗已经授权给Soligenix公司进行进一步的临床试验以期最终成为FDA批准的军用罕见药。

基于ATA研制的生防疫苗较少，2008年Surendranath等[12]应用抗ATA的IgG单抗(D6F10)免疫小鼠，同样能保护其免受致死剂量的AT攻击。2011年Han等[7]采用定点突变技术获得ATA突变体(mABRAE164AR167L)，其毒性降低为天然AT的1/8 000，重组未突变的A链蛋白的1/1 350，用该疫苗免疫后的小鼠能抵抗10×LD50剂量的天然毒素攻毒，显示出良好的免疫原性。

2.3基于B链蛋白的疫苗关于RT和AT的疫苗研制，重点大多基于A链亚单位，而关于B链亚单位的研究很少，这是因为很多研究者认为B链的免疫原性远不如A链[5,7,9-12]，所以不适合做疫苗候选。研究人员采用一系列单抗(RTA、RTB、全毒素)进行小鼠体内保护实验，通过分型、相关亲和力和表位特异性进行评价，实验结果表明无论是主动免疫还是被动免疫，免疫A链比B链能诱导出更好的保护性。但也有研究者认为B链亚单位同样具有很好的免疫原性[13，14]。以RT为例，理由主要包括：RTB在缺少RTA的情况下无毒；抗RTB抗体可以静脉保护小鼠，就像抗RTA抗体可以保护静脉或皮下的RT攻击；基于B亚单位的疫苗已被其他的A-B家族的毒素证明是有效的，如白喉、破伤风、霍乱和志贺毒素。最后，RTB已成功地在哺乳动物细胞中表达[15]。而且由于RTB能刺激抗体阻断呼吸道和肠道的上皮细胞，如研究发现抗RTB的IgA抗体(不是RTA)能阻断毒素结合人类肠道上皮细胞(具体数据未公开)，因此可能是对诱导体液免疫特别有效。早在1987年，研究者就应用D型RT的抗RTB单抗IgG Fab片段(75/3B12)免疫动物，能在体外抵抗30～100倍RT毒性。Mantis等[15]应用灌胃法免疫类毒素的BALB/c小鼠的派式集合淋巴结和肠系膜淋巴结获得4株抗IgA单抗(IgA MAbs)，2株针对RTB，2株针对RTA。通过Vero细胞毒性实验、Caco-2和MDCKⅡ细胞毒性实验等一系列结果说明4株均能中和RT。抗RTA、RTB的IgA均能保护RT中毒的黏膜上皮细胞。Prigent等[16]联合3种单抗(2个抗RTB和1个抗RTA)，在5×LD50鼻内注射RT后7.5 h后静脉给药，表明可以有效地抵挡暴露后预防鼻内RT的攻击。此外，包括RT和AT在内的几种植物凝集素由于具有特异结合细胞表面M细胞(M-cells)的特性而被认为是一种潜在的疫苗佐剂或载体[7]。如RTB和绿色荧光蛋白(GFP)在烟叶中成功地进行融合表达，该融合蛋白既有GFP荧光特性，又有半乳糖/半乳糖氨结合活性。鼻腔免疫结果显示结合RTB免疫的GFP出现IgGs，与单独使用GFP相比，这种强体液免疫和用霍乱毒素作为佐剂的效果相同；由于激发了Th2反应，导致与IgG2a相比，可以诱导出更高水平的IgG1；血液和排泄物的抗GFP IgA也能被融合蛋白诱发。数据显示RTB可以作为佐剂和抗原载体运输到黏膜并有效诱发体液和黏膜免疫反应。以上实验结果表明关于RT和AT的B链亚单位是否适合成为安全的候选疫苗依然存在争议。

3　其他

选择性小分子抑制剂-Retro-2[8]。Retro-2虽不能作用于毒素本身，但能逆转毒素的运输，从而影响宿主细胞和毒素的相互作用，而且实验表明Retro-2对Hela细胞无毒。使用该抑制剂在毒素攻击前1 h静脉给药可以保护小鼠免受毒素鼻内致死剂量的攻击。这为RT和AT的疫苗研制提供了另一种暴露前主动免疫的思路。

4　结语

针对RT和AT引起的生物战和生物恐怖事件的最有效的预防方法之一，就是研制适合人类接种的、安全有效的生防疫苗。目前国内外研制工作主要集中在RT，而针对AT则相对较少，但由于后者的毒性更强，一旦被恐怖分子所利用造成的危害更大，因此发展AT的疫苗研制同样重要。同时，针对毒素的研制也主要集中在基于A链亚单位的各种重组疫苗或以脂质体微囊化的方式传递类毒素，B链亚单位的研制则由于免疫原性的争议而研究较少，更不要说针对两种毒素中毒的预防疫苗。目前我们分别将原核表达单独毒素的B链亚单位(RTB、ATB)、两毒素B链嵌合体(RTB-ATB)蛋白[6]为免疫原进行免疫接种，并与相应的A链亚单位及嵌合体蛋白进行比较，评价其免疫原性，为发展和研制蓖麻、相思子毒素疫苗提供另一条途径。

[1]Reisler RB,Smith LA.The need for continued development of ricin countermeasures [J].Adv Prev Med,2012,2012:149737.

[2]Neal LM,McCarthy EA,Morris CR,etal.Vaccine-induced intestinal immunity to ricin toxin in the absence of secretory IgA [J].Vaccine,2011,29(4):681-689.

[3]Wang JH,Gao S,Xin WW,etal.A novel recombinant vaccine protecting mice against abrin intoxication [J] .Hum Vaccin Immunother,2015,11(3):1-7.

[4]Pincus SH,Smallshaw JE,Song KJ,etal.Passive and active vaccination strategies to prevent ricin poisoning [J].Toxins (Basel),2011,3(9):1163-1184.

[5]Marconescu PS,Smallshaw JE,Pop LM,etal.Intradermal administration of Rivax protects mice from mucosal and systemic ricin intoxication [J].Vaccine,2010,28(32):5315-5322.

[6]Wang JH,Gao S,Zhang T,etal.A recombinant chimeric protein containing B chains of ricin and abrin is an effective vaccine candidate [J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(4):1-7.

[7]Han YH,Gao S,Xin WW,etal.A recombinant mutant abrin A chain expressed in Escherichia coli can be used as an effective vaccine candidate [J].Hum Vaccin Immunother,2011,7(8):838-844.

[8]Anastasiya Y,Tove IK,Richard C,etal.Antibody-mediated inhibition of ricin toxin retrograde transport [J].mBio,2014,5(2):e00995-13.

[9]Porter A,Phillips G,Smith L,etal.Evaluation of a ricin vaccine candidate (RVEc) for human toxicity using an in vitro vascular leak assay [J].Toxicon,2011,58(1):68-75.

[10]Janosi L,Compton JR,Legler PM,etal.Disruption of the putative vascular leak peptide sequence in the stabilized ricin vaccine candidate RTA1-33/44-198 [J].Toxins,2013,5:224-248.

[11]Hassett KJ,Cousins MC,Rabia LA,etal.Stabilization of a recombinant ricin toxin A subunit vaccine through lyophilization [J].Eur J Pharm Biopharm,2013,85(2):279-286.

[12]Surendranath K,Karande AA.A neutralizing antibody to the A chain of abrin inhibits abrin toxicity both in vitro and in vivo [J].Clin Vaccine Immunol,2008,15(5):737-743.

[13]Herrera C,Vance DJ,Eisele LE,etal.Differential neutralizing activities of a single domain camelid antibody (VHH) specific for ricin toxin′s binding subunit (RTB) [J].PLoS One,2014;9(6):e99788.

[14]Abboud N,Chow SK,Saylor C,etal.A requirement for FcR in antibody-mediated bacterial toxin neutralization [J].J Exp Med,2010,207(11):2395-2405.

[15]Mantis NJ.Vaccines against the category B toxins:Staphylococcal enterotoxin B,epsilon toxin and ricin [J].Adv Drug Deliv Rev,2005,57(9):1424-1439.

[16]Prigent J,Panigai L,Lamourette P,etal.Neutralising antibodies against ricin toxin [J].PLoS One,2011,6(5):e20166.

[收稿2016-04-18]

(编辑张晓舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.030

①本文受武警后勤学院开放基金(WHKF201503)和军事预防医学“2110”三期工程建设项目资助。

王俊虹(1977年-)，女，博士，讲师，主要从事生物战剂的侦检和防治的研究,E-mail：wangjunhong11007@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)10-1547-04

②同时供职于天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津300309。