CD4+T细胞在绝经后骨质疏松症发病机制中的调控作用①

许莹萍 邱学敏 桂玉燕 张 娜 王 凌

(复旦大学附属妇产科医院，复旦大学中西医结合研究院，上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海200011)



CD4+T细胞在绝经后骨质疏松症发病机制中的调控作用①

许莹萍 邱学敏 桂玉燕 张 娜 王 凌

(复旦大学附属妇产科医院，复旦大学中西医结合研究院，上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海200011)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMO)是绝经后女性的常见病，是导致绝经后女性骨折的主要原因，研究表明[1]骨质疏松性骨折的发病率很高，仅在美国每年就有150万例发生，同时骨折使各种并发症发生风险增加，如帕金森病、多发性硬化症、肺和心脏等疾病[2]。雌激素减少是绝经后女性发生骨质疏松最主要的原因[3]，雌激素是维持骨量的关键激素[4]，所以PMO是雌激素减少介导的骨丢失，以往雌激素补充疗法一直是治疗本病的主要治疗方法，它可以缩短破骨细胞(Osteoclast，OC)寿命，减少绝经后妇女体内OC生成，增加OC凋亡，抑制骨重吸收。近来发现CD4+T细胞在PMO发病中发挥重要作用，研究表明，CD4+T细胞缺陷的小鼠模型，卵巢切除术(Ovariectomy ,OVX)不能诱导骨丢失，但在自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK细胞)代偿性分泌促破骨生成因子，如IL-17分泌增加，或重新移植CD4+T细胞后，OVX又诱导了骨丢失，说明CD4+T细胞在雌激素下降介导骨丢失中扮演至关重要的角色，本综述旨在阐述CD4+T细胞在雌激素缺乏介导骨丢失中的作用，为PMO治疗提供新的靶点。

1 CD4+T细胞调控破骨细胞-成骨细胞平衡

活化的CD4+T细胞在骨和免疫系统间的相互作用中扮演关键的角色，在维持破骨细胞-成骨细胞平衡中发挥重要作用，CD4+T细胞被认为是在不同疾病中调节成骨细胞(Osteoblast，OB)、OC形成及活性的关键细胞，如：类风湿性关节炎、牙周炎、先天性肾上腺皮质增生、骨质疏松症等[5]。有一类CD4+T细胞可以产生IL-17和TNF-α，我们称之为TNF-α阳性的Th17细胞。在慢性炎症如炎症性肠病或克罗恩病时TNF-α阳性的TH17细胞迁移至骨髓，一方面可补充骨髓破骨细胞祖细胞[6]，另一方面也可通过表达TNF-α、IL-6、GM-CSF，诱导破骨细胞生成，介导骨丢失[7]。体外研究表明，Th17细胞产生IL-17，IL-17通过诱导OB表达核因子κB受体激动剂配体(Ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL)刺激OC生成，但Th1和Th2型细胞分别通过产生IFN-γ和IL-4抑制OC形成[8]。炎症时，活化的CD4+T细胞可直接分泌可溶性RANKL和TNF-α，也可通过分泌IL-1、IL-6、IL-17等促骨吸收因子刺激OB和成纤维细胞，在细胞膜表面表达或分泌可溶性RANKL，促进OC形成[7]。Won等[9]人以TallyHo/JngJ 鼠(TH鼠，2型糖尿病的多基因模型)为模型研究证实，TH鼠与野生型小鼠相比，其胸腺及淋巴结CD4+T细胞数量增多，从而显著提高RANKL表达，增加IL-17生成，使用瘦素治疗TH鼠，增强TH鼠CD4+T细胞IL-17基因转录，分泌IL-17，诱导RANKL表达，增加OC生成，使骨量显著减少。体内OC生成受OB调节，OB通过产生RANKL调节破骨生成。活化的CD4+T细胞分泌的破骨细胞生成因子(Secreted osteoclastogenic factor of activated T cells，SOFAT)并不通过该途径，SOFAT不影响OB生长及其免疫活性，不影响机体RANKL mRNA和蛋白质水平，SOFAT在骨代谢方面的作用机制为非RANKL依赖性，SOFAT通过刺激MC3T3细胞(成骨细胞前体细胞株)分泌IL-6、IL-10和GM-CSF，激活Janus激酶-信号转导和转录激活因子3信号通路(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway，JAK/STAT3信号通路)，上调BCL2、IL-1B、IL-10、IL-22、IL2RA、IL-4、IL-6、TNFSF10和PIAS3的基因表达，抑制IL-2、IL-21、CD4、CSF3R基因表达，促进OC形成和骨吸收，介导骨丢失[10]。与CD4+T细胞直接分泌促骨吸收因子相比，幼稚型和活化的CD4+T细胞也能通过分泌GM-CSF、IL-3、IFN-γ、IFN-β、IL-4、IL-10、IL-13、骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)、破骨细胞植物血凝素、分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled-related proteins，sFRPs)等白介素和细胞因子,干扰RANKL-RANK信号通路，从而抑制OC形成及其功能[7,9]。例如，IL-18可通过作用于CD4+T细胞显著增加GM-CSF的产量，IL-12促进CD4+T细胞生成IFN-γ，抑制OC形成[7]。

2 雌激素对成骨细胞及破骨细胞生物学行为的调控

体内骨量和骨强度稳定状态的维持依赖OB和OC的共同协调。骨质疏松症是一组以低骨量、骨组织微细结构退化、骨脆性和骨折敏感性增加为特征的系统性骨骼疾病[5]。女性绝经后，体内雌激素水平下降或缺乏，免疫系统紊乱，OC形成增加、活性增强、寿命延长，机体骨重吸收增加，使体内骨重吸收大于骨形成，导致PMO发病。雌激素主要通过雌激素受体-alpha(estrogen receptor α，ERα)、雌激素受体-beta(estrogen receptor β，ERβ)及膜结合型雌激素受体发挥生物学作用。体内雌激素水平的变化会影响OB和OC的生物学行为。

2.1 雌激素对OB生物学行为的调控 雌激素可通过多种途径作用于OB。雌二醇(Estradiol，E2)诱导OB碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)和骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein 2，Bmp2)转录从而调节OB分化[11]；有研究表明雌马酚(一种主要的大豆异黄酮，是一种植物雌激素)，能通过ER增加OB的骨钙素水平和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性[12]，通过激活雌激素受体-蛋白激酶C-α(estrogen receptor-protein kinase C alpha，ER-PKCα)相关信号通路促进鼠OB增殖和分化，促进骨形成；雌激素水平降低会扩张骨髓基质细胞池，促进多能间充质干细胞向OB前体细胞分化，提高早期OB前体细胞的增殖，刺激成骨发生，但同时又使OB活力和寿命减少，增加OB凋亡。

2.2 雌激素对OC生物学行为的调控 OC起源于骨髓造血干细胞，直接参与骨吸收，OC数量、活性、寿命的变化会直接影响机体骨平衡。巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL在破骨细胞前体细胞转化为成熟的破骨细胞的过程中发挥重要作用。在合适的骨髓基质细胞微环境下，单核细胞、巨噬细胞能分化为成熟的OC[13]。绝经后骨质疏松症患者血液雌激素水平下降，外周血单核细胞会自发性形成OC[14]。

在体内，雌激素与OC关系密切，雌激素受体激活可降低OC代谢活性，E2作用于OB表面ERα，通过诱导OB Fas配体的转录间接作用于OC表面Fas，从而诱导OC凋亡[15]。有研究证实[16]雌激素可直接或间接影响OC形成和活性，①经典途径：雌激素结合于OC表面的雌激素受体，使雌激素受体构象改变，通过细胞内信号传导通路，作用于目标基因启动子上的特殊雌激素反应原件，使基因转录[17]，导致相关蛋白质产物的mRNA水平增加或减少，降低OC活性[18]；②非经典转录途径：雌激素-雌激素受体复合物与另外的转录因子、AP-1、NF-κB、SP-1共同激活，结合于非雌激素受体-雌激素位点，通过刺激一般转录机制调节基因表达，从而影响OC形成和激活[19]；③除了经典和非经典核通路，在破骨细胞内，非基因组信号的启动通过膜结合型雌激素受体和GPR30影响OC活性，它们作为急性反应原件，可在数分钟内被启动。此外，雌激素减少，通过上调骨髓细胞[20]、成骨细胞和免疫细胞[21]产生的前破骨细胞生成因子,使破骨细胞前体细胞增加，骨转换增加。雌激素可刺激OPG表达，抑制RANKL表达，增加OPG/RANKL比值，通过抑制活化T细胞核因子1蛋白(Activation of T cell nucleus factor 1 protein，NFATc1)的活性抑制RANKL介导的OC分化[22]。雌激素可通过增加香草素受体亚家族(Transient receptor potential vanilloid，TRPV)5通道的表达，抑制RANKL介导的OC分化和骨吸收[23]。另外，体内雌激素水平降低通过扩张OC池，延长OC寿命，抑制OC凋亡，刺激骨吸收；也可通过MKK3、MKK6调节骨丢失，MKK3可直接调节OC生成，MKK6通过产生前炎症细胞因子(如：IL-1、TNF-α、IL-6)，增加OB和基质细胞RANKL表达，促进骨吸收或促进单核细胞向OC分化[24]。另外，雌激素减少可直接作用于OB，使OB分泌TNF-α、RANKL、IL-6等细胞因子促进前破骨细胞分化为OC[11]。总之，雌激素减少对机体的效应是骨吸收大于骨生成。

3 雌激素通过调控CD4+T细胞调节骨代谢

PMO患者体内雌激素减少，CD4+T细胞表达CD40L增加，一方面，促进基质细胞表达M-CSF、RANKL，另一方面可下调OPG，增加破骨细胞生成率。Yokoyama等[16,25]人的实验结果显示抗CD40L的免疫球蛋白能抑制OC生成。说明CD4+T细胞产生的CD40L在OC形成中发挥重要作用。同时，体内雌激素减少使胸腺源性CD4+T细胞输出增加，外周CD4+T细胞增加，CD4+T细胞激活，分泌TNF-α、RANKL诱导OC形成和骨丢失[16]。

3.1 E2通过调节Th1型、Th2型细胞因子调控骨代谢 Th1细胞是由Th0细胞在IL-12等细胞因子作用下分化而成，主要分泌IL-2、IL-12、IFN-α、IFN-γ、TNF-α等，功能为辅助细胞毒性T细胞分化，介导细胞免疫应答，参与迟发型超敏反应等。Th2细胞主要为对抗细胞外多细胞寄生虫的免疫反应，其主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子。

CD4+T细胞是雌激素介导骨吸收的关键步骤，在雌激素减少的条件下，Th1细胞产生TNF-α，TNF-α是重要的促进骨吸收的细胞因子，可直接增强成熟OC的活性，增加成熟OC对重要的破骨细胞生成因子受体和RANKL反应的敏感性，直接或间接增加OC形成和骨重吸收，或通过激活OB和基质细胞RANKL的活性间接刺激OC生成[26,27]。另外，在雌激素缺乏的条件下，TNF-α通过肌细胞生长因子2(Myocyte enhancer factors 2 ，MEF2)转录刺激硬骨素的表达[28]，有研究表明硬骨素具有诱导OB凋亡的作用，能增加骨重吸收，减少骨形成。

雌激素减少，体内TGF-β减少，IL-7增加，使Th1细胞表达IFN-γ增加，增加巨噬细胞反式激活蛋白(CⅡTA)的表达[29](CⅡTA是MHC Ⅱ启动子的转录共刺激物，可上调巨噬细胞MHC Ⅱ的表达)，使巨噬细胞和树突状细胞抗原表达增加，激活TNF-α，同时也可使Th1细胞产生TNF-α增加，一方面促进骨髓基质细胞表达RANKL激活巨噬细胞的RANKL的信号通路，增强RANKL在破骨细胞生成过程中的作用，另一方面使效应CD4+T细胞增殖，促使OC分化。

机体雌激素减少，体内前炎症细胞因子水平发生相应变化，如：IL-4等。雌激素促进IL-5和IL-13的产生[30]。在IFN-γ或IL-4存在的情况下，RANKL和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)都能诱导形成破骨样细胞，在相同条件下，LPS诱导的细胞群获得更多的破骨细胞样属性，说明在炎症条件下，适应性免疫，无论是通过Th1或Th2细胞因子都能修改破骨细胞的分化过程[31]。且在鼠模型上证实[32]IL-4与IL-13对破骨细胞分化发挥抑制作用，且IL-4的抑制作用比IL-13强。

3.2 调节性T细胞在PMO中的调控作用 Treg细胞与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可致自身免疫性疾病。有研究报道Treg细胞在绝经后妇女抗骨质疏松中扮演重要角色。Treg细胞在体内能控制骨重吸收，在生理和病理骨重建时能维持骨量。Treg细胞能抑制OC功能、分化和形成。Treg细胞表达FoxP3，FoxP3转基因小鼠与野生型小鼠相比有更高的骨量，体内OC分化和骨重吸收受损，骨量增加[33]。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可通过细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)介导的细胞与细胞间直接作用抑制M-CSF、RANKL途径的OC形成，Treg细胞还可通过刺激IL-10、TGF-β1的分泌抑制OC分化和骨吸收[34]。

3.3 Th17细胞在PMO发病机制中的作用 Th17细胞是一种能够分泌IL-17的CD4+T细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。Th17细胞分泌IL-17、RANKL、TNF-α、IFN-γ等细胞因子参与骨代谢调节。Th17细胞的主要效应因子是IL-17。IL-17是骨丢失的重要中介物。在炎症时IL-17增加OC生成。抗IL-17抗体不仅能减少前炎症细胞因子的产生，诱导生成抗炎症细胞因子，同时能诱导Treg细胞抑制骨吸收。Tyagi等[35]的实验表明：成年小鼠用抗RANKL抗体、抗TNF-α抗体、抗IL-17抗体皮下处理，每周两次，去势术后4周进行尸体解剖，发现抗RANKL抗体和抗TNF-α抗体治疗的小鼠对去势术诱导CD4+T细胞增殖没有影响，抗IL-17抗体却有效的抑制CD4+T细胞增殖并且逆转CD28的丢失。说明IL-17在去势术诱导CD4+T细胞增殖中发挥作用。体内雌激素减少时Th17细胞数量增多，IL-17分泌增加，IL-17通过增加OB来源的TNF-α、IL-6、RANKL等前破骨细胞因子，支持OC生成，抑制OB分化，从而诱导骨丢失；IL-17既可调节OC分化，又可抑制OB矿化结节的形成，但是IL-17的这些功能可被E2抑制；同时雌激素减少，通过作用于雌激素受体上调STAT3、ROR-γt、ROR-α基因表达，下调Foxp3(Foxp3具有抗Th17细胞分化的作用)，使Th17细胞分化增加。因此IL-17在OVX诱导骨丢失中扮演关键角色，可能是治疗绝经后骨质疏松症的潜在靶点[15]。

4 总结

PMO作为绝经后妇女的常见病，影响到绝经后妇女的生活质量，目前对PMO的治疗方法主要为激素替代疗法和二膦酸盐，但这些治疗的副作用使人们追求更加完美的治疗方案。对CD4+T细胞在PMO发病机制中发挥的作用进行更深入的研究有望为本病的治疗带来新靶点。

[1] Chow SK,Leung KS,Qin L，etal. Callus formation is related to the expression ratios of estrogen receptors-alpha and-beta in ovariectomy-induced osteoporotic fracture healing [J].Arch Orthop Trauma Surg,2014,134(10):1405-16.

[2] Watts NB,GLOW investigators.Insights from the Global Longitudinal Study of Osteoporosis in Women(GLOW)[J].Nat Rev Endocrinol,2014，10(7):412-22.

[3] Corina M,Vulpoi C,Brǎnisteanu D.Relationship between bone mineral density,weight,and estrogen levels in pre and postmenopausal women [J].Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2012,116(4):946-50.

[4] Riggs BL,Khosla S, Melton LJ 3rd.Sex steroids and the construction and conservation of the adult skeleton.Endocrine reviews [J].Endocrine reviews ,2002,23(3):279-302.

[5] Faienza MF,Ventura A,Marzano F，etal.Postmenopausal Osteoporosis:The Role of Immune System Cells [J].Clinical and Developmental Immunology,2013：575936.

[6] Ciucci T,Ibáez L,Boucoiran A ,etal.Bone marrow Th17 TNFα cells induce osteoclast differentiation,and link bone destruction to IBD [J].Gut,2015,64(7):1072-1081.

[7] Gillespie MT.Impact of cytokines and T lymphocytes upon osteoclast differentiation and function [J].Arthritis Res Therapy,2007,9(2):103-105.

[8] Sato K,Suematsu A,Okamoto K，etal.Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction [J].J Exp Med,2006,203(12):2673-2682.

[9] Won HY,Lee JA,Park ZS，etal.Prominent bone loss mediated by RANKL and IL-17 produced by CD4+T cells in tallyho/JngJ mice [J].PLoS One,2011,6(3):e18168.

[10] Napimoga MH,Demasi AP,Jarry CR，etal.In vitro evaluation of the biological effect of SOFAT on osteoblasts [J].Inter Immunopharmacol,2015,26(2):378-383.

[11] Krum SA.Direct transcriptional targets of sex steroid hormones in bone [J].J Cell Bioch,2011,112(2):401-408.

[12] Wang J, Xu J,Wang B，etal.Equol promotes rat osteoblast proliferation and differentiation through activating estrogen receptor [J].Genetics Mol Res,2014,13(3):5055-5063.

[13] Udagawa N,Takahashi N,Asatsu T，etal.Origin of osteoclasts:mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells [J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(18):7260-7264.

[14] D′Amelio P,Grimaldi A,Pescarmona GP，etal.Spontaneous osteoclast formation from peripheral blood mononuclear cells in postmenopausal osteoporosis [J].FASEB J,2005,19(3):410-412.

[15] Krum SA,Miranda-Carboni GA,Hauschka PV，etal.Estrogen protects bone by inducing Fas ligand in osteoblasts to regulate osteoclast survival [J].EMBO J,2008,27(3):535-545.

[16] D′Amelio P.The immune system and postmenopausal osteoporosis [J].Immunological Investigations,2013,42(7):544-554.

[17] Ascenzi P,Bocedi A,Marino M.Structure-function relationship of estrogen receptor α and β:Impact on human health [J].Molecular Aspects Med,2006,27(4):299-402.

[18] Smith CL,O′Malley BW.Coregulator function:a key to understanding tissue specificity of selective receptor modulators [J].Endocrine Reviews,2004,25(1):45-71.

[19] Acconcia F,Kumar R.Signaling regulation of genomic and nongenomic functions of estrogen receptors [J].Cancer Letters,2006,238(1):1-14.

[20] D′Amelio P,Roato I,D′Amico L，etal.Bone and bone marrow pro-osteoclastogenic cytokines are up-regulated in osteoporosis fragility fractures [J].Osteoporosis International,2011,22(11):2869-2877.

[21] Onal M,Xiong J,Chen X，etal.Receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)protein expression by B lymphocytes contributes to ovariectomy-induced bone loss [J].J Biol Chem,2012,287(35):29851-29860.

[22] Park K,Ju WC,Yeo JH，etal.Increased OPG/RANKL ratio in the conditioned medium of soybean-treated osteoblasts suppresses RANKL-induced osteoclast differentiation [J].Int J Mol Med,2014,33(1):178-184.

[23] Chen F,Ouyang Y,Ye T，etal.Estrogen inhibits RANKL-induced osteoclastic differentiation by increasing the expression of TRPV5 channel [J].J Cell Biochem,2014,115(4):651-658.

[24] Boyle DL,Hammaker D,Edgar M，etal.Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss [J].PLoS One,2014,9(1):1-9.

[25] Yokoyama M,Ukai T,Ayon Haro ER，etal.Membrane-bound CD40 ligand on T cells from mice injected with lipopolysaccharide accelerates lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis [J].J Periodontal Res,2011,46(4):464-474.

[26] Weitzmann MN, Pacifici R.The role of T lymphocytes in bone metabolism [J].Immunological Reviews,2005,208:154-168.

[27] Weitzmann MN,Pacifici R.Estrogen deficiency and bone loss:an inflammatory tale [J].J Clin Invest,2006,116(5):1186-1194.

[28] Kim BJ,Bae SJ,Lee SY.TNF-α mediates the stimulation of sclerostin expression in an estrogen-deficient condition [J].Bioche Biophysical Res Communi,2012,424(1):170-175.

[29] Teitelbaum SL.Postmenopausal osteoporosis,T cells,and immune dysfunction [J].Proc Natl Acad Sci,2004,101(48):16711-16712.

[30] Cai Y, Zhou J,Webb DC.Webb,estrogen stimulates Th2 cytokine production and regulates the compartmentalisation of eosinophils during allergen challenge in a mouse model of asthma [J].Intern Archives Allergy Immunol,2012,158(3):252-260.

[31] Hu Y,Ek-Rylander B,Wendel M，etal.Reciprocal effects of Interferon-γ and IL-4 on differentiation to osteoclast-like cells by RANKL or LPS [J].Oral Diseases,2014,20(7):682-692.

[32] Wang Y,Wu NN,Mou YQ，etal.Inhibitory effects of recombinant IL-4 and recombinant IL-13 on UHMWPE-induced bone destruction in the murine air pouch model [J].J Surg Res,2013,180(2):E73-E81.

[33] Zaiss MM,Sarter K,Hess A，etal.Increased bone density and resistance to ovariectomy-induced bone loss in FoxP3-transgenic mice based on impaired osteoclast differentiation [J].Arthritis & Rheumatism,2010,62(8):2328-2338.

[34] Luo CY,Wang L,Sun C，etal.Estrogen enhances the functions of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells that suppress osteoclast differentiation and bone resorption in vitro [J].Cell Mol Immunol,2011,8(1):50-58.

[35] Tyagi AM,Mansoori MN,Srivastava K，etal.Enhanced Immunoprotective Effects by Anti-IL17 Antibody Translates to Improved Skeletal Parameters Under Estrogen Deficiency Compared to Anti-RANKL and Anti-TNF-α Antibodies [J].J Bone Mineral Res,2014,29(9):1981-1992.

[收稿2015-04-15 修回2015-07-15]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.030

①本文受上海市医学引导类项目(15401932200)、上海市浦江人才计划(11PJ1401900)、国家自然科学基金(30801502)、日本学术振兴会海外博士后研究员项目(P08471)、国家自然科学基金(81401171)、国家自然科学基金(31571196)、上海市高峰学科(中西医结合，20150407)建设项目资助。

许莹萍(1991-)，女，在读硕士，主要从事神经-生殖内分泌-免疫调节方面研究，E-mail：ypxu14@fudan.edu.cn。

及指导教师：王 凌(1977-)，女，医学博士，副研究员，硕士生导师，主要从事神经-生殖内分泌-免疫调节方面研究，E-mail：dr.wangling@fudan.edu.cn。

R711

A

1000-484X(2016)04-0584-04