由CRISPR-Cas介导的细菌和古细菌的适应性免疫系统

郑海青 汪晶波 刘 丹 赵华锋 佟刚强

(湖北省当阳市中医院检验科，宜昌444100)



由CRISPR-Cas介导的细菌和古细菌的适应性免疫系统

郑海青 汪晶波 刘 丹 赵华锋 佟刚强

(湖北省当阳市中医院检验科，宜昌444100)

最新研究发现，微生物有一套以核酸为基础的适应性免疫系统，这改变了之前研究者认为的微生物免疫系统仅局限于固有免疫系统的认识[1]。细菌与古细菌通过整合外源性核酸片段到宿主染色体成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)一端，从而获得对病毒及质粒的抗性。本文对这种免疫系统的功能进行了总结，并讨论了这种可遗传的免疫系统的进化意义。

1 CRISPR的生物学特性

CRISPR最早由Ishino等[2]在1987年发表的对大肠杆菌iap基因3′下游序列的描述中观察得到，但此后一直未能引起研究者的重视。直到2002年Jansen等[3]通过生物信息学方法在细菌和古细菌基因组中找出短重复序列以及与重复序列相关的基因，并正式将此种序列命名为“成簇的规律间隔的短回文重复序列”(CRISPR)，与其相关的蛋白编码基因命名为CRISPR相关基因(CRISPRE associated genes,Cas)，有关CRISPR的相关研究才真正铺展开来。随后对CRISPR进行系统的研究发现该系统是一个具有不同DNA重复片段(长度为20～50个碱基对)的超家族[4]，在重复片段的上游还具有cas基因，其编码的Cas蛋白具有遗传与功能的多样性，且是CRISPR系统亚型分类的依据。尽管CRISPR重复序列具有多样性，但大多数重复序列在3′-端都有一个保守的GAAA(C/G)基序，是一个或多个保守Cas蛋白的结合位点[5]。除了重复序列和间隔序列具有多样性之外，CRISPR位点的数目及每个基因座的长度也是可变的。不同的CRISPR位点数及这些重复阵列的长度与基因组大小无关，一些最小的微生物基因组，如纳米古细菌可包含多个CRISPR位点，且在一些基因组中，CRISPR可占染色体总量的1%以上，如硫化叶菌。重复序列-间隔序列-重复序列的模式是公认的CRISPR位点决定性特征[6]。富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的序列被称为引导序列，往往位于CRISPR位点的两侧。比较分析显示，最接近引导序列的间隔序列是最多样的，离引导序列最远的重复序列往往会被降解[7]。前导序列含有启动子元件[5]和结合调节蛋白的位点[8]，这对CRISPR RNA(crRNA)的表达与新序列的获得至关重要[9]。CRISPR包括三种亚型：(1)Ⅰ型CRISPR/Cas系统广泛分布于细菌和古细菌中[10]。Ⅰ型系统包括六个不同的亚型(A～F)，所有这些类型都编码cas3基因。cas3包含一个N末端HD磷酸水解酶结构域和C末端DExH解旋酶结构域[11]；(2)Ⅱ型系统只存在于细菌中[12]，包括四个cas基因：cas9，cas1，cas2和csn2(Ⅱ-A型)或cas 4(Ⅱ-B型)。cas9基因是该系统的一大特点，它编码一个大型多功能蛋白，这个蛋白既参与crRNA生物合成也参与入侵DNA的降解[13]；(3)目前已鉴定出两个Ⅲ型系统(Ⅲ-A型和Ⅲ-B型)[14]，这些系统在古细菌中更为常见。Ⅲ-B型系统只能与其他CRISPR类型一起发挥作用。两个Ⅲ型系统都能编码cas10和cas6基因。Cas6是CRISPR特异性的核糖核酸内切酶，Cas10则与目标序列的干扰相关[15]。

2 CRISPR介导免疫的三个阶段

CRISPR/Cas系统介导的免疫保护包括三个阶段：CRISPR调节、crRNA生物合成及crRNA指导的干扰。在噬菌体侵入的初期，CRISPR/Cas复合物首先靶向裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列，进而将其整合到宿主基因组中CRISPR 位点的5′-端。然后，这些原型间隔序列被转录成crRNA。最后，实现对入侵的噬菌体DNA 序列的干扰[16]。

2.1 CRISPR调节 大量研究表明，外源性DNA整合到CRISPR位点是一种普遍存在的现象，CRISPR转录子是噬菌体新型防御机制的核心组件，作用类似于真核生物的RNA干扰(RNA interference，RNAi)[17]。如Perez-Rodriguez等[18]从酸奶样品中分离到两种不同的噬菌体，感染嗜热链球菌后筛选到九株噬菌体抗性的突变株。所有突变株都含有1～4个新的间隔序列，且这些新间隔序列均整合到了CRISPR位点的引导序列端，这表明间隔序列是提供免疫保护的关键所在，从而证实了噬菌体的抗性可通过在CRISPR位点插入或删除噬菌体靶向间隔来达到增强或削弱的目的。虽然间隔序列的整合机制仍然尚不明确，但基于研究者对嗜热链球菌和大肠杆菌的研究，目前已鉴定出了几种参与该过程的Cas蛋白。如Babu等[19]研究发现，Cas1和Cas2是参与整合过程的保守核酸酶。值得注意的是，Cas1和Cas2的过表达足以在大肠杆菌BL21(DE3)染色体的内源性CRISPR位点前导序列端添加新的间隔序列重复单元[20]。目前，前导序列端的准确识别机制尚不明确，但可以肯定的是，前导序列的突变能够阻断转录且不干扰整合；与此相反，引导序列的前60个核苷酸的突变可使整合终止。引导序列的前60个核苷酸是必需的，但至少有一个重复序列，整合过程才会发生。除了Cas1和Cas2外，大肠杆菌I-E型的CRISPR系统还包括六种其他的Cas蛋白。虽然这些蛋白并非是获得新序列的必需蛋白，但当系统中存在这些蛋白质时，新序列的获得模式会发生变化[21]。如Swarts等[22]研究发现，在大肠杆菌系统中有完整的8种(类型I-E家族)cas基因，CRISPR位点往往通过获得多个新的间隔序列而增大。第一个间隔序列的获取往往会加速随后的间隔序列的获得，并且所有的间隔序列可来源于同一个DNA链。此外，噬菌体抗性水平的增加也与目标特异性的间隔序列的数量相关；因此，对特定信号响应的快速延伸的CRISPR位点的机制可限制噬菌体突变的机会。

2.2 CRISPR RNA的生物合成 2008年，Brouns等[23]确定了CRISPR特异性内切核糖核酸酶Cas6e(以前称作CasE或Cse3)对大肠杆菌(I-E型)中前体crRNA的处理，Cas6e是多样性蛋白大家族中的一员，这个家族被称为重复序列相关的神秘蛋白质(Repeat-associated mysterious proteins，RAMP)。所有的RAMP蛋白都含有至少一种RNA识别基序(RNA recognition motif，RRM)和保守的富含甘氨酸的环(Glycine rich loop，G环)。RRMs由一个保守的β1α1β2β3α2β4排列组成，其中β链组成了四条链反平行排列的β片层，两个螺旋一起位于片层的一面[24]。这种折叠已在多种不同的RNA结合蛋白中发现，常常通过位于β-片层开放面的保守残基结合RNA。Cas6e蛋白质的晶体结构揭示了两个结构域组成一个N端和C端的RRM[25]。一个富含脯氨酸的短接头连接两个结构域，β-片层中的各个RRM面之间则形成蛋白质表面上的V形槽。这个裂缝最初预测是RNA结合面，但Cas6e与crRNA结合的共结晶结构揭示了一个非典型的结合机制，涉及到序列和结构的特异性相互作用，主要是位于蛋白的相反面。大肠杆菌CRISPR的重复序列部分回文，产生一个具有稳定7 nt的茎环结构的RNA，有一个由GCGU四环组成的帽子结构。Cas6e C-末端结构域带正电的β-发夹与RNA双链体的大沟相互作用，且位于蛋白质带正电裂缝的3′-链磷酸骨架上[26]。RNA结合诱导构象的变化，从而破坏茎的底部碱基对，并且发生在酶活性位点伸展构象的易断裂磷酸上。切除机制是不依赖金属离子的，并且发生在茎的基部，产生一个有5′-羟基和2′,3′-环状磷酸酯的成熟crRNA。成熟的crRNA(～61 nt)由32-nt的间隔序列相邻的5′-端8-nt的重复序列(也称为5′手柄)和21个核苷酸的3′端的21-nt的剩余重复序列组成的。Cas6e仍然绑定到3′-茎-环结构作为召集大型监测复合物-CRISPR内切核糖核酸酶复合体(CRISPR ribonuclease complex，Cascade)的核点，这是免疫系统下一步沉默靶基因所必需的[27]。

2.3 CRISPR RNA指导的干扰 所有的crRNAs都可与Cas蛋白联系形成大的CRISPR相关的核糖核蛋白复合物，但这些复合物是如何在拥挤的含有大量非目标核酸(非靶RNA和DNA)的胞内环境中找到与crRNA互补的短目标序列的呢？研究表明，许多DNA结合蛋白能够用比纯粹的随机碰撞高得多的手段定位它们的同源结合位点。一些蛋白质通过静电吸引到带负电荷的糖-磷酸主链，进而非特异结合到DNA上加速靶标的发现。最初的结合后往往发生分子内易位，被称为一维滑动。与耗能马达蛋白(即聚合酶、解旋酶、错配修复酶和Ⅰ型限制性内切酶)的定向运动相反，DNA滑动是热扩散驱动的能源独立的过程[28]。然而，DNA的初步结合是一个没有引导的过程，受到一维扩散的限制。因此，一个包括3D组件的搜寻过程可加速靶标的发现。所有CRISPR系统目标的识别都包括crRNA-间隔区序列与互补核酸靶序列的杂交。大肠杆菌的crRNA引导监视复合物为Cascade，其可优先结合到长的负超螺旋双链DNA(质粒或噬菌体DNA)上[29]。负超螺旋压缩双链DNA，从而1D距离很远的序列可在3D空间位置上接近，从而大大加快了双链DNA结合蛋白的搜寻过程[30]。此外，负超螺旋状态，有利于链的分离。如Westra等[31]最近发现负超螺旋提供了分离32 nt双链DNA大约一半的能量。crRNA间隔序列的前8个核苷酸对靶标的结合最为重要。crRNA间隔序列区域被认为是种子序列，并且与种子序列互补的靶序列的单核苷酸突变会导致严重的结合缺陷。与此相反，即使靶标上非种子序列出现多个错配，仍可进行高亲和力结合，并可在噬菌体感染期间发挥正常作用[32]。

3 CRISPR介导的适应性免疫及其应用

在筛选噬菌体抵抗的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus,S.thermophilus)过程中，Barrangou等[32]首次阐明S.thermophilus对噬菌体产生的抵抗作用是由其CRISPR从噬菌体基因组中获得新的间隔序列而得到的，这种与噬菌体DNA高度同源的片段一旦整合进入细菌基因组DNA中便产生了具有该噬菌体特异性抗性的菌株。此后Garneau等[33]研究发现S.thermophilus亦能从外源性质粒中获得间隔序列，从而通过RNA介导的Cas蛋白特异性地清除质粒，产生对该质粒免疫的菌株。

CRISPR介导的适应性免疫系统与哺乳动物相较，都具有特异性、多样性以及记忆性这三大特征。CRISPR系统通过将与噬菌体、病毒或者外源质粒同源的片段整合进间隔序列中，以此获得相应的特异性清除噬菌体、病毒或质粒DNA的能力。同时通过将不同来源的DNA片段整合进入间隔序列，细菌由此实现CRISPR适应性免疫的多样性。并且由于新的间隔序列直接整合进入基因组当中，该免疫特性得以在细胞分裂过程中予以保留并最终实现免疫记忆[34]。

CRISPR的应用目前主要集中于生物医药及发酵奶制品菌种改造和分子生物技术两方面。事实上，CRISPR在S.thermophilus中作用机制的阐明便得益于工业化生产中对噬菌体抗性菌株的强烈需求，由此推动了相关分子机制的研究，并由此在生产实践中对工业上生产用菌株进行改造，通过CRISPR筛选获得对噬菌体等病毒具有抗性的菌株，达到减少生产过程中噬菌体污染的所带来经济损失的目的[35]。除此之外，CRISPR作用机制发现的更大意义在于其带给分子生物学领域的重大技术革新，CRISPR/Cas9在基因编辑上的优势使其迅速得到应用并与RNAi技术并列成为日常实验中哺乳动物基因敲除手段之一[36]。甚至于中国科学家最近使用CRISPR/Cas9技术成功地对人废弃胚胎β球蛋白基因进行了敲除，虽然这一实验引起了世界范围内的巨大争议，但仍然应该看到CRISPR/Cas9在未来进行人类疾病基因治疗的潜力[37]。

4 结论与展望

20世纪80年代，海洋病毒学家报道，1升海水中含有大约一百亿个噬菌体，而这些病毒被普遍认为是地球上最丰富多样的生物，这些病毒带来的选择压力对微生物群落的组成和行为产生深远的影响，微生物宿主已经进化形成了不同的机制来逃避感染[38]。除了以限制修饰和受体转变为代表的先天防御机制外，近八年的研究发现微生物还有一套以核酸为基础的适应性免疫系统-CRISPR。无论从论文数还是论文质量来看，CRISPR无疑是近三年来的研究明星。随着对CRISPR研究的深入，该系统的实际应用价值将会愈发凸显。

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[收稿2015-09-07 修回2015-12-23]

(编辑 张晓舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.035

郑海青(1975年-)，男，主管技师，主要从事微生物及分子免疫学相关研究，E-mail:ycdyzhenghaiqing@sina.com。

R37

A

1000-484X(2016)04-0605-04