致病性蜡样芽胞杆菌的研究进展

刘　芳　罗　臻　黄静敏　兰全学（深圳市计量质量检测研究院　广东深圳　518131）

致病性蜡样芽胞杆菌的研究进展

刘芳罗臻黄静敏兰全学
（深圳市计量质量检测研究院广东深圳518131）

概述了蜡样芽胞杆菌的生物学特性、致病性及其检测方法，并探讨各种检测方法的优点和局限性。有助于对食品中蜡样芽孢杆菌污染进行风险评估，为食品安全风险管理提供依据。

蜡样芽胞杆菌；致病性；检测

1　前言

在我国，细菌性微生物是导致食源性疾病发生的主要病因，严重危及人们的健康，成为目前较为突出的公共卫生问题之一，每年我国食源性致病菌导致数千万人次发病，由此造成的损失巨大。我国的主要食源性致病菌包括沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、溶血性链球菌（Streptococcus hemolyticus）、大肠埃希氏菌O157（Escherichia coli O157）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）等。其中，蜡样芽胞杆菌引发的食物中毒问题越来越受到人们的关注。蜡样芽胞杆菌是芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌，兼性需氧，广泛分布于土壤、灰尘和污水中，也是食品中常见污染菌和条件致病菌［1］。少量摄入蜡样芽胞杆菌不会引起食物中毒，只有其在食物中成指数生长才会产生肠毒素。一般认为蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒属毒素型食物中毒。

2　蜡样芽胞杆菌的生物学特性

蜡样芽胞杆菌菌体大小为 （1.0 μm-1.2 μm）× （3.0 μm-5.0 μm），芽孢呈椭圆形，在营养肉汤中32℃培养3 d后，芽孢形成率在90%以上，80℃-85℃水浴5 min-10 min可刺激芽孢萌发；最高生长温度35℃-45℃，最低生长温度10℃-20℃，10℃以下和63℃以上不繁殖，65℃-70℃菌体易死去；最适生长pH为4.3-9.3；在葡萄糖洋菜上生长的菌落细胞含有复红不着色的小球，不产生细胞内蛋白晶体［2］；在普通琼脂上形成的菌落较大，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状；甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基上菌落为粉红色、周围有白色的沉淀环［3］；蜡样芽孢杆菌能够发酵葡萄糖产酸，不发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，有运动性，可还原硝酸盐，分解酪氨酸，厌氧时可利用葡萄糖，过氧化氢酶试验、卵黄反应、V-P反应呈阳性，能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶［4］。

3　蜡样芽孢杆菌的致病性

在细菌性食物中毒事件中，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒比较常见。早在1973年，Bulyba等人就报道了污染蜡样芽孢杆菌的乳制品引起食物中毒［5］。1994-2003年十年内，国内报道的蜡样芽孢杆菌食物中毒共47起，其中食物中毒进食人数2541人，中毒者1758人，发病率69.19%，但是无一人死亡［6］。据2008-2010年我国突发公共卫生事件报告管理信息系统统计，我国细菌性食物中毒中，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒在发生起数和发病人数方面均居前三位［7］。

蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒临床表现为发病急，来势猛，主要症状为恶心、呕吐和腹泻。蜡样芽胞杆菌是条件致病菌，主要是通过产生腹泻毒素和呕吐毒素导致食物中毒，偶见菌体感染引起眼疾、心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病［1］。食品中蜡样芽孢杆菌数量超过105CFU/g时即可导致呕吐和腹泻，呕吐的主要原因是某些菌株代谢产生了热稳定的呕吐毒素，而腹泻与蜡样芽孢杆菌分泌的各种肠毒素有关［8］。呕吐毒素是一种环形肽，分子量为1 153.38 u，在126℃加热90 min和在pH 2-12的条件下仍有活性，主要中毒症状为恶心、呕吐，伴有腹泻、头晕、发烧和四肢无力等症状，与金黄色葡萄球菌引发的食物中毒现象类似，中毒的潜伏期一般为0.5 h-6 h，一般限于富含淀粉质的食品，特别是米饭。腹泻毒素是一种分子量在38000 u-46000 u之间的蛋白质，56℃下加热5 min失活，遇到胰蛋白酶或胃蛋白酶失活，有抗原性；中毒症状类似于产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）食物中毒现象：水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，呕吐很少见。常因食用肉类、海鲜、乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6 h-15 h，一般持续24 h［9-11］。

蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒可分为呕吐型和腹泻型两类［12］，主要毒力因子包括：与呕吐毒素相关的非核糖体多肽合成酶系（NRPS）基因［13］；与腹泻毒素相关的溶血素 BL基因 （hblA、hblB、hblC和hblD）、非溶血性肠毒素Nhe基因 （nheA、nheB和nheC）、肠毒素 FM 基因 （entFM）、肠毒素T基因（bceT）和细胞毒素K基因 （cytK）［14］。hblA、hblB、hblC、hblD基因可以编码相应蛋白 HblA、HblB、HblC、HblD；nheA、nheB、nheC编码相应蛋白NheA、NheB、NheC；bceT和cytK基因分别编码肠毒素T和细胞毒素K。

4　蜡样芽胞杆菌检测方法的国内外研究现状

目前，国内外对于蜡样芽孢杆菌的检测方法，主要有生化检测方法、PCR技术、免疫学技术等。

4.1生化检测方法

生化检测方法原理是通过目标菌生长过程中产生的酶和代谢物的生化反应判断是否为蜡样芽孢杆菌。生理生化试验一般涉及葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、改良V-P试验、L-酪氨酸分解试验、溶菌酶试验、动力试验、溶血试验、蛋白毒素结晶试验等［15-16］。GERVASYM等［17-18］利用反向被动乳胶凝集试验（RPLA）检测食品中的蜡样芽孢杆菌；黄训端等［19］利用VITEK自动鉴定系统鉴定了草莓蜡样芽孢杆菌，并与分子生物学的验证结果一致，表明VITEK的可靠性和准确性。生化检测方法的优点是技术成熟、易操作，标准检验方法在微生物实验室易推广，耗材成本低，对人员技术要求不高。

然而，生化检测方法操作步骤繁琐，检测周期长，商品化鉴定试剂盒的应用虽然可以缩短检测周期，但高额的成本不利于应用推广［4］。另外，生化检测方法无法检测毒力基因，对蜡样芽孢杆菌致病性无法进行评估［20］。

4.2基于PCR的检测方法

PCR检测技术特异性强，灵敏度高，近年来在食源性致病菌检测方面得到了广泛应用。王振国［21］等分别通过扩增gyrB与hblA基因实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测。VESAM等［22］发现，通过PCR筛选HblA基因检测蜡样芽孢杆菌方法比RPLA更快；BJARNE M H等［23］建立了利用PCR技术区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的方法。由于蜡样芽孢杆菌毒力基因的多样性和个体差异性，不能通过单一毒力因子的检测判定其致病因子，普通PCR技术有一定局限性。

多重PCR（mPCR）技术能满足同时扩增多种DNA序列的需要，与普通PCR相比，更加快速、准确和灵敏度高，能够高效地检测编码多重毒素的蜡样芽孢杆菌。Dzieciol等［24］针对蜡样芽孢杆菌gyrB、16S rRNA和编码呕吐毒素的基因ces构建了mPCR体系，成功检测出人工污染牛奶中产呕吐毒素和不产毒蜡样芽孢杆菌，检测限达 1.91×103CFU/mL；Wehrle等［25］利用溶血素基因 hbl、非溶血素基因 nhe和细胞毒素基因 cytK设计引物构建 mPCR，对引起腹泻的蜡样芽孢杆菌进行了检测，结果显示所检测的108份食物样品中有14份被产肠毒素蜡样芽孢杆菌污染；Yang等［26］利用5种不同的产肠毒素基因和一种产呕吐毒素基因共设计了12对引物，构建了的 mPCR方法检测出蜡样孢杆菌所有已知毒素基因；蒋培余等［27］通过设计引物和探针，优化反应条件，建立多重实时PCR，检测蜡样芽孢杆菌16S rRNA保守区基因及其ces基因（编码致呕毒素cereulide）与菌株鉴定结果的符合率为100%，蜡样芽孢杆菌的 ces基因检测结果也与普通 PCR结果相符。mPCR能检测到食品中产毒素和不产毒素的蜡样芽孢杆菌，在实际检测中具有较强应用价值。然而由于mPCR涉及到多对引物和不同模板，所以在实验初期要对反应体系的条件进行优化，检测时间较长。

荧光定量PCR（qPCR）检测技术与常规PCR相比，更加快速准确，重复性好，且能定量，可用于产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌引起食物中毒的快速鉴定。artinez等［28］以磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C基因（pcplc）为靶基因首次对食品中活的蜡样芽孢杆菌进行了qPCR定量检测，在人工污染的液态蛋样品中检测限能达到1.1×104CFU/mL；Lim等［29］针对groEL和ces设计引物和探针，分别特异性检测不产和产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌，在纯培养物中的检测限均为1.0×100CFU/反应，并能准确检测豆酱样品中的产毒和不产毒蜡样芽孢杆菌；Hansen等［30］用hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC和bceT为目的基因设计引物，采用qPCR技术对63株产肠毒素蜡样芽孢杆菌的毒素基因分布进行了分析；王红［31］等通过qPCR技术检测34株疑似蜡样芽孢杆菌溶血素基因，33株均为阳性，符合率为97.1%。快速、灵敏及准确定量的特点使qPCR技术对食物中食源性致病菌进行定量检测的应用更加广泛。

4.3免疫学检测技术

免疫学检测方法主要是酶联免疫吸附测定法（ELISA），具有检测时间短、成本低、灵敏度高、特异性强等优点。Day等［32］在1994年首次利用ELISA法对蜡样芽孢杆菌的致腹泻型肠毒素进行检测；CHEN CH等［33］报道了用蛋白印记技术（Colony Blot Immunoassay CBI）快速检测蜡样芽抱杆菌的方法；Wehrle等［25］利用蜡样芽孢杆菌的特异性抗体对产肠毒素蜡样芽孢杆菌的Hbl-L2、NheA、NheB和NheC进行检测，结果发现该方法不适用于蜡样芽孢杆菌的检测。利用抗体的方法虽然检测速度较快，但易产生交叉反应。另外，区分活细胞和死细胞需要针对特征性蛋白制备抗体，难度较大，对检测人员的技术水平要求较高，并且检测结果的稳定性和重现性相对较低。

5　结语

目前蜡样芽孢杆菌污染问题已是家庭饮食及公共餐饮业存在的一个主要的问题。有报道的蜡样芽孢杆菌引发的食物中毒，多是和人们生活息息相关的食品。乳制品、蒸煮的米饭和炒饭、调味料、粮食制品、豆制品、肉制品、烘焙食品等食品都易发生蜡样芽孢杆菌引发的食物中毒。一般而言，该菌在食品中大于105CFU/g时，即可能引起食物中毒，这进一步提高了对食品的安全性要求。并非所有蜡样芽孢杆菌都具有致病性，只有部分菌株携带了与致病性相关的毒力基因，才会导致食源性疾病，因此对这些致病性菌株的毒力基因分布特征进行研究具有十分重要的意义。

现行国家标准中蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、劳动强度大、检验成本高，因此急需建立致病性蜡样芽孢杆菌的快速检测体系，探索其毒力因子分布特征，有效弥补国内相关检测标准的不足，为食品安全监管以及临床诊断提供可靠的手段。而且，了解食品中蜡样芽孢杆菌主要毒力基因型，有助于食品中蜡样芽孢杆菌的风险评估，为食品安全风险管理提供实验数据；对于建立和完善细菌性食源性疾病监测和预警系统，增强对细菌性食源性疾病暴发的反应和预警能力，降低细菌性食源性疾病的发生率起着重要的作用。

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Research Progress of Pathogenic Bacillus Cereus

LIU Fang，LUO Zhen，HUANG Jingmin，LAN Quanxue
（Shenzhen Academy of Metrology&Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong，518131）

Biologicalcharacteristics，pathogenicityanddetectionmethodsofBacilluscereusare introduced.Theadvantagesandlimitationsofeachdetectionmethodsarediscussed.Thispaper contributes to risk evaluation and administration of B.cereus contamination in food.

Bacillus cereus；Pathogenicity；Detection

TS207.4

E-mail：4275777@qq.com

2015-07-17