禽巴氏杆菌株粘附蛋白基因的克隆和序列分析

段世雄1，吾鲁木汗·那孜尔别克1,2，恩特马克·布拉提白1,2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；

2.伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆 伊宁 835000)



禽巴氏杆菌株粘附蛋白基因的克隆和序列分析

段世雄1，吾鲁木汗·那孜尔别克1,2，恩特马克·布拉提白1,2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；

2.伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆 伊宁 835000)

摘要：用PCR从禽巴氏杆菌P-1059基因组DNA中分别扩增编码粘附蛋白OmpH，PtfA，PlpE和PM1665的基因序列，将PCR产物克隆到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选含有重组质粒DNA的重组子，并对目的基因进行测序.DNA测序结果表明，P-1059株ompH，plpE，ptfA和pm1665基因大小分别为1 032，1 008，435，348 bp，分别编码343，335，144，115个氨基酸的多肽.Blast分析结果显示，P-1059株与已报道不同血清型巴氏杆菌ompH基因的同源性为95%~97%，与ptfA基因的同源性为95%~99%，与plpE基因的同源性为94%~97%，而与pm1665基因的同源性为99%.克隆得到的ompH，ptfA，plpE和pm1665基因，为禽巴氏杆菌粘附因子及其致病机理的研究奠定基础.

关键词：禽多杀性巴氏杆菌；粘附蛋白；基因克隆；核苷酸序列同源性

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，简称巴氏杆菌)是革兰氏阴性的短杆菌，能感染畜禽并引发猪萎缩性鼻炎和肺炎、牛出血性败血症、兔脓血症和鸟类禽霍乱等疾病.根据细胞壁表面荚膜多糖(Capsular polysaccharide)的抗原性，将巴氏杆菌分为A，B，D，E和F等5种荚膜血清型，而根据细胞壁脂多糖(Lopopolysaccharide)的抗原性将巴氏杆菌分为16种菌体血清型[1-2].临床研究表明，引起禽霍乱的菌株一般为血清型A∶1，A∶3和A∶4的巴氏杆菌，而其余血清型的巴氏杆菌能引起猪萎缩性鼻炎、牛出血清败血症、兔脓血症等疾病，给养殖业造成严重的经济损失[3-4].目前，国内外用灭活疫苗和活疫苗来预防巴氏杆菌病，但这些疫苗存在保护周期短、交叉保护作用差和易出现毒力返强等缺点，所以至今本病未得到有效控制.国内外学者普遍认为，有效抑制细菌与宿主粘膜细胞表面相应受体的结合过程是控制病原菌传染的关键步骤，而病原菌的菌毛、荚膜和外膜蛋白一般具有粘附作用和免疫保护作用[5-6].因此，研究禽巴氏杆菌菌体表面粘附素及其致病机理，为禽霍乱的预防和治疗提供十分重要的线索.

Dabo S M等[7]对A型牛源巴氏杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)的编码基因进行了表达和纯化并检测其粘附作用，结果显示重组rOmpA和其抗体均能抑制细菌对牛肾细胞的粘附.Mullen L M等[8]用PCR从A型猪源巴氏杆菌基因组中扩增纤连蛋白结合蛋白(fibronection binding protein)的编码基因pm1665，并对pm1665基因进行了表达和纯化，粘附试验结果显示重组rPM1665和其抗血清均能抑制牛源巴氏杆菌对纤连蛋白的结合.Ruffolo C G等[9]用RP-HPLC法从A型巴氏杆菌菌毛提取液中纯化得到18 ku的蛋白并测定其氨基酸序列，结果表明其N端21个氨基酸序列与绿脓杆菌、节瘤拟杆菌、淋球菌和牛莫拉氏菌等病原菌的IV型菌毛亚单位蛋白(type IV fimbrial subunit protein，PtfA)具有很高的同源性，因此将其命名为巴氏杆菌IV型菌毛亚单位蛋白PtfA，而Western印迹结果显示抗PtfA抗体分别能够与A，B，D型巴氏杆菌的18 kDa蛋白质结合，表明不同血清型巴氏杆菌都具有PtfA.Wu J R等[10]对A∶1型禽源巴氏杆菌的编码脂蛋白E(P.multocidalipoprotein E，PlpE)进行了克隆和表达，动物实验结果显示重组rPlpE免疫组鸡对X-73株攻毒的保护率为100%，而对P-1059株(A∶3)和P-1662株(A∶4)攻毒的保护率为80%.Steen J A等[11]发现禽源巴氏杆菌荚膜自发突变与fis基因单点突变密切有关，并验证fis基因是荚膜多糖生物合成基因和plpE基因的正调控因子.Borrathybay E等[12]的研究表明，A型禽源巴氏杆菌的OmpH具有粘附作用，与本菌的致病性密切相关.从上述研究结果可以看出，外膜蛋白和菌毛在A型巴氏杆菌对宿主的感染和致病过程中发挥重要作用，但它们的致病机理尚未清楚.笔者对A型禽源巴氏杆菌P-1059株的ptfA，plpE，pm1665和ompH基因进行克隆和测序，为禽源巴氏杆菌致病机理研究奠定基础.

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、试剂及培养基血清型A∶3禽巴氏杆菌P-1059株购自中国兽医菌种保藏管理中心;pMD18-T载体为大连宝生物工程公司产品；大肠杆菌DH5α为本实验室保存；细菌基因组DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，标准DNA DL2000，PCR试剂盒、限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ均为大连TaKaRa公司产品；Dextrose Starch Agar(DSA)和Tryptose Broth(TB)培养基为Difco公司产品.

1.1.2 引物设计根据禽巴氏杆菌P-1059株的ompH基因和plpE基因的核苷酸序列设计2对引物，根据禽巴氏杆菌Pm70株基因组DNA序列设计扩增pm1665和ptfA基因的引物，引物序列及其在GenBank数据库中的登录号见表1.引物由上海生工生物工程有限责任公司合成.

表1　引物的序列、位置及扩增片段长度

注禽巴氏杆菌P-1059株ompH和plpE基因的GenBank登录号分别为EF203904a和EF219455b；cpm1665和ptfA基因在禽巴氏杆菌Pm70株基因组序列(AE004439)中的相应位置.

1.2 方法

1.2.1 目的基因的PCR扩增将禽巴氏杆菌P-1059株接种于10 mL的TB液体培养基37 ℃培养18 h，用细菌基因组提取试剂盒制备基因组DNA.用引物OmpH-F/OmpH-R从P-1059株基因组中扩增出编码OmpH的ompH基因，PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min.用引物PlpE-F/plpE-R从P-1059株基因组中扩增出plpE基因，PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min.用引物PM1665-F/PM1665-R从P-1059株基因组中扩增出pm1665基因，PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；35个循环；72 ℃延伸10 min.用引物PtfA-F/PtfA-R从P-1059株基因组中扩增出ptfA基因，PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s；35个循环；72 ℃延伸10 min.用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.

1.2.2 目的基因的克隆和测序用切胶回收试剂盒纯化PCR产物，用T4DNA连接酶将PCR产物连接至pMD18-T 载体中，转化大肠杆菌DH5α，将转化子涂布于含有氨苄青霉素和X-Gal的LB琼脂平板上培养18 h.随机挑取抗氨苄青霉素抗性的单个白色菌落，接种于5 mL的LB液体培养37 ℃培养18 h，用质粒DNA提取试剂盒制备质粒DNA，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切检测这些质粒DNA是否含有相应的目的基因片段.将双酶切鉴定正确的质粒DNA送上海生工生物工程有限责任公司进行序列测定.

1.2.3 目的基因序列的同源性分析用NCBI数据库中的Blast软件对目的基因序列进行同源性分析，从GenBank数据库中调取与目的基因序列同源性较高的相关基因序列，用ClustalW软件分析P-1059株和相关参考菌株基因的同源性.

2结果与讨论

2.1 目的基因的PCR扩增结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示，用引物对OmpH-F/OmpH-R，PlpE-F/PlpE-R，PM1665-F/PM1665-R和PtfA-F/PtfA-R从禽巴氏杆菌P-1059株基因组DNA中分别扩增大小约为1.0，0.9，0.4，0.3 kb的PCR产物(见图1)，与预期结果相符.

M—标准DNA DL2000;1—PCR产物ompH基因;2—PCR产物plpE基因;3—PCR产物ptfA基因;4—PCR产物pm1665基因.图1　禽巴氏杆菌P-1059株目的基因的PCR扩增

2.2 重组质粒DNA的鉴定

随机挑取氨苄青霉素抗性的单个白色菌落，将其接种于5 mL的LB液体培养基37 ℃培养18 h，用质粒DNA提取试剂盒提取制备质粒DNA.琼脂糖凝胶电泳显示，从白色菌落中提取的质粒DNA大小显著大于pUC18空载体(见图2(a)).酶切鉴定结果显示，用BamHI和SalI双酶切重组质粒pMD18-OmpH，pMD18-PlpE，pMD18-ptfA和pMD18-PM1665后观察到大小约为1.1，1.0，0.4，0.3 kb的DNA片段(见图2(b))，与预期值相符.

M—λ-HindIII酶切的标准DNA;1—空质粒pUC18;2—pDM18-OmpH;3—pDM18-PlpE;4—pDM18-PtfA;5—pMD18-PM1665.

1—BamHI和SalI酶切的pDM18-OmpH;2—BamHI和SalI酶切的pDM18-PlpE;3—BamHI和SalI酶切的pDM18-PtfA;4—BamHI和SalI酶切的pMD18-Pm1665.

2.3 目的基因的序列分析

DNA测序结果表明，血清型A∶3禽巴氏杆菌P-1059株ompH，plpE，ptfA和pm1665基因序列长度分别为1 032，1 008，435，348 bp，GenBank登录号分别为EF203904，EF219455，KP726887和KP726888.同源性对比显示：P-1059株ompH基因与已报道的A型巴氏杆菌CU株(登录号：U52213)的同源性为97%，与A型巴氏杆菌HN06株(CP003313)和D型巴氏杆菌HN-13株(AY864815)的同源性均为95%；P-1059株plpE基因与已报道的血清型A∶3巴氏杆菌P-470株(EF219453)、血清型A∶4巴氏杆菌P-1662株(EF219456)、血清型B∶2巴氏杆菌(GQ202239)、血清型A∶5巴氏杆菌C48-1株(GU108958)的同源性均为97%，而与血清型A∶1巴氏杆菌X-73株(EF219452)和血清型D∶11巴氏杆菌ATCC12948株(EF219457)的同源性分别为96%和94%；P-1059株ptfA基因与已报道的血清型A∶1巴氏杆菌IndPm94株(JX139092)和Pm70株(AE004439)的同源性均为99%，而与血清型B∶2巴氏杆菌P52株和血清型D∶1巴氏杆菌的同源性分别为98%和95%；P-1059株pm1665基因与已报道的血清型A∶1巴氏杆菌Pm70株(AE004439)和HN06株(CP003313)的同源性均为99%.

上述结果表明，粘附蛋白基因ompH，plpE，ptfA和pm1665基因序列在不同血清型巴氏杆菌中具有较高的保守性.

3结语

Borrathybay E等[12]研究表明，A禽巴氏杆菌外膜蛋白OmpH是本菌对鸡胚成纤维(Chicken Embryo Fibroblast，CEF)细胞的粘附因子，而OmpH含量与荚膜厚度直接相关.吾鲁木汗等[13]通过同源重组原理构建了血清型A∶1禽巴氏杆菌C48-3株ompH基因的缺失突变株ΔompH，用生物学功能实验检测突变株的荚膜结构和致病性，结果证实ompH基因的缺失突变影响细菌荚膜多糖的合成能力，与母株C48-3相比突变株对CEF细胞的粘附能力显著降低，而突变株对小鼠的致病性相对减弱.最近，韦东等[14]比较C48-3株和突变株ΔompH的血清抵抗性和抗吞噬作用，结果显示野生株在鸡血清中的存活率显著高于突变株，而小鼠腹腔巨噬细胞对突变株的吞噬能力显著高于野生株.上述研究表明，OmpH在血清型A∶1禽巴氏杆菌对宿主的感染和治病过程中发挥重要的作用.笔者对血清型A∶3禽巴氏杆菌标准菌株P-1059株的ompH基因进行了克隆和测序.测序结果显示，P-1059株ompH基因长度为1 032 bp，与A型巴氏杆菌CU株和D型巴氏杆菌HN-13株的同源性分别为97%和95%，表明不同血清型巴氏杆菌ompH基因序列可能有较大的差异.

Wu J R等[10]的研究表明，血清型A∶1禽源巴氏杆菌的脂蛋白PlpE具有交叉保护作用，它可以作为禽霍乱亚单位疫苗的候选抗原.Steen J A等[11]发现血清型A∶1禽源巴氏杆菌fis基因的突变导致荚膜的自发突变并降低plpE基因表达水平，暗示PlpE可能与禽巴氏杆菌的致病性相关，但其致病性及其致病机理尚未清楚.笔者对血清型A∶3禽巴氏杆菌P-1059株的plpE基因序列进行克隆和序列分析，结果显示plpE基因大小为1 008 bp，编码335个氨基酸的多肽，与已报道的血清型A∶3，A∶4，A∶5和B∶2巴氏杆菌plpE基因序列的同源性均为97%，而与血清型A∶1和D∶11巴氏杆菌的同源性低于95%，表明不同血清型巴氏杆菌plpE基因序列有较大的差异.

Ruffolo C G等[9]首次从A型巴氏杆菌菌毛提取液中纯化得到了Ⅳ型菌毛亚单位蛋白PtfA，通过免疫实验验证PtfA在A，B，D型巴氏杆菌中普遍存在.但是禽巴氏杆菌PtfA的致病作用尚未清楚.因此，笔者对血清型A∶3禽巴氏杆菌ptfA基因进行了克隆和测序，结果显示P-1059株ptfA基因序列长度为435 bp，编码335个氨基酸，与血清型A，B，D型巴氏杆菌的同源性分别为99%，98%和95%，表明不同血清型巴氏杆菌ptfA基因序列存在较大的差异.Mullen L M等[8]的研究表明，A型巴氏杆菌基因的PM1665蛋白具有粘附作用，其受体是宿主细胞表面的纤连蛋白(fibronection)，但PM1665蛋白的致病作用尚未清楚.本研究结果表明，P-1059株pm1665基因长度为348 bp，编码115个氨基酸，与已报道的血清型A∶1巴氏杆菌的同源性为99%.

采用PCR从血清型A∶3禽巴氏杆菌基因组DNA中分别扩增出ompH，plpE，ptfA和pm665基因，并确定它们的核苷酸序列，为进一步开展OmpH，PlpE，PtfA和PM1665的表达及其致病机理研究奠定基础.

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(责任编辑陈炳权)

Cloning and Sequencing of Adhesive Protein Genes of

AvianPasteurellaMultocida

DUAN Shixiong1,NAZIERBIEKE Wulumuhan1,2,BORRATHYBAY Entomack1,2

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China;2.College of

Chemistry and Biological Sciences,Yili Normal University,Yining 835000,Xinjiang China)

Abstract:The genes encoding the outer membrane protein H (OmpH),lipoprotein E (PlpE),type 4 fimbrial subunit protein (PtfA) and fibronectin binding protein (PM1665) were amplified by PCR from genomic DNA of avianPasteurellamultocidaP-1059,respectively.The PCR products were cloned into the pMD18-T vector and then sequenced.Sequence analyses showed that the open reading frames (ORFs) of theompH,plpE,ptfAandpm1665 genes were 1 032,1 008,435 and 348 bp in length,and encoded the 343,335,144 and 115 amino acid residues.Nucleotide sequence homologies of theompH,plpE,ptfAandpm1665 genes between the P-1059 and the previously reported different serotype strains ofP.multocidawere 95%~97%,95%~99%,94%~97% and 99%,respectively.In conclusion,the cloned genes encoding the adhesive proteins of avianP.multocidaP-1059 will contribute to further study on pathogenesis of this organism.

Key words:Pasteurellamultocida;adhesive protein;gene cloning;nucleotide sequence homology

通信作者：恩特马克·布拉提白(1961—)，男，新疆伊犁昭苏县人，伊犁师范学院化学与生物科学学院教授，博士，主要从事动物病原微生物学研究.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30972206,31360613)

作者简介：段世雄(1984—)，男，湖南长沙人，吉首大学生物资源与环境科学学院硕士研究生，主要从事微生物分子生物学研究

收稿日期：2015-01-16

中图分类号：Q751

文献标志码：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-2985.2015.02.015

文章编号：1007-2985(2015)02-0077-05