健脾散结方对Lewis肺癌小鼠细胞相关凋亡蛋白及端粒酶活性的影响

谭国柱　王秀娟

(莱芜市人民医院肿瘤科，山东　莱芜　271100)



健脾散结方对Lewis肺癌小鼠细胞相关凋亡蛋白及端粒酶活性的影响

谭国柱王秀娟

(莱芜市人民医院肿瘤科，山东莱芜271100)

摘要〔〕目的观察健脾散结方对Lewis肺癌小鼠细胞相关凋亡蛋白及端粒酶活性的影响。方法选用C57BL/6小鼠接种Lewis肺癌细胞建立动物模型，按实验分组分别干预21 d，观察肿瘤生长情况，采用SABC免疫组化法检测Survivin、c-myc表达，PCR-ELISA法检测端粒酶活性。结果健脾散结方组、顺铂组、联合组的抑瘤率分别为42.36%、57.38%、69.71%；与模型组比较，各药组均可降低Survivin 与c-myc 表达(P<0.05或P<0.01)，且联合组最明显，健脾散结方与顺铂有协同作用；各药组端粒酶活性均低于模型组(P<0.05)，且健脾散结方组、顺铂组与联合组比较均有显著差异(P<0.05)。结论健脾散结方抑制肿瘤作用可能与下调Survivin、c-myc表达，诱导细胞凋亡，抑制端粒酶活性有关。

关键词〔〕健脾散结方；肺癌；细胞凋亡；端粒酶

第一作者：谭国柱(1965-)，男，副主任医师，主要从事肿瘤研究。

肺癌在临床恶性肿瘤中最为常见，其发病率与死亡率逐年上升，防治形势十分严峻，中西医结合治疗是肺癌多学科治疗的重要手段之一，辨证论治、遣方用药无不体现出独特的优势〔1〕。健脾散结方是我科长期临床实践总结出的有效方药，从脾着手，培土生金，治疗肺癌取得了较好疗效。因此，本研究探讨健脾散结方对Lewis 肺癌小鼠细胞相关凋亡蛋白及端粒酶活性的影响及其相关机制。

1材料与方法

1.1实验动物与瘤株C57BL/6小鼠60只，雄性，体重(200±20)g；Lewis 肺癌细胞株，均购于中国医学科学院。

1.2主要药物试剂与仪器药物：健脾散结方由黄芪，党参，陈皮，半夏，莪术，全蝎，蜈蚣，白花蛇舌草组成，水煎制成汤剂，浓缩至生药1 g/ml，4℃保存备用；注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)。试剂：SABC免疫组化试剂盒、Survivin、c-myc一抗、抗原修复液(均为武汉博士德生物有限公司)，端粒酶PCR-ELISA试剂盒(Roche公司)。仪器：高速冷冻离心机、微量高速离心机(上海医学仪器厂)，多功能显微镜、石蜡包埋机、组织切片机、全封闭自动脱水机(均为德国Leica 公司)，HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统(武汉同济医科大学千屏影像工程公司)，酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3动物模型建立与分组将Lewis肺癌细胞株分别接种于10只C57BL/6小鼠右侧腋下，待小鼠右腋部皮下瘤体隆起明显时于无菌条件下取出瘤体，研磨，稀释，制备细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/L，每只0.2 ml接种于50只C57BL/6小鼠右侧腋窝皮下，复制Lewis 肺癌小鼠模型，造模成功后选取40只随机分为模型组、健脾散结方组、顺铂组、联合组(顺铂+健脾散结方)四组，每组10只；四组分别给予生理盐水、健脾散结方制剂、顺铂稀释液、健脾散结方制剂+顺铂稀释液0.2 ml/次灌胃，2次/d，共干预21 d，末次用药后24 h内处死取材。

1.4肿瘤生长情况各组小鼠处死后称取小鼠体重，完整剥取移植瘤体称取其重量，计算抑瘤率，抑瘤率计算公式：抑瘤率=(模型组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。

1.5免疫组化检测Survivin、c-myc表达组织固定，常规切片、脱蜡至水化，3%H2O2灭活内源性酶，热修复抗原，5%BSA封闭液，一抗4℃过夜，二抗室温20 min，SABC室温20 min，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片；显微镜观察，胞质、胞核或胞膜为棕黄色颗粒为阳性表达，高清晰度彩色病理图文分析系统分析。

1.6PCR-ELISA检测端粒酶活性常规制备Lewis 肺癌小鼠细胞悬液，充分裂解，冰上孵育30 min，4℃离心20 min，取上清液；端粒酶扩增，ELLSA，酶标仪检测，具体步骤参照试剂盒说明书逐步进行。端粒酶活性(RTA)=(AS1-AS0)/AS2/(TS1-TS0)/TS2〔2〕。

1.7统计学处理采用SPSS18.0软件进行统计学分析，组间比较行单因素方差分析。

2结果

2.1肿瘤生长情况经实验干预，各药组瘤重明显低于模型组(P均<0.05)，其中联合组最低，与健脾散结方组及顺铂组比较均有显著差异(P<0.01)。联合组抑瘤率最高(P<0.05)。见表1。

组别瘤重(g)抑制率(%)模型组1.81±075-健脾散结方组1.16±0.641)3)42.363)顺铂组0.93±0.582)3)57.383)联合组0.75±0.502)69.71

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与联合组比较:3)P<0.05

图1　各组Survivin、c-myc表达(DAB，×200)

2.2免疫组化检测Survivin、c-myc表达各药组Survivin表达均低于模型组(P均<0.05)，且健脾散结方组与顺铂组的表达均高于联合组(P均<0.05)；各药组c-myc表达均低于模型组(P<0.05)，联合组低于健脾散结方组与顺铂组(P<0.05)。见表2，图1。

组别Survivinc-myc模型组66.31±7.2459.73±9.82健脾散结方组56.34±5.491)4)51.64±7.601)4)顺铂组43.81±6.982)3)43.59±6.421)3)联合组32.97±6.702)35.31±5.822)

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与联合组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3PCR-ELISA检测端粒酶活性模型组、健脾散结方组、顺铂组及联合组的端粒酶活性依次降低，分别为10.12±3.41、7.27±2.64、5.33±2.47、3.98±1.29。

3讨论

中医药在肺癌治疗中，具有提高生活质量、延长生存期的特点，其作用机制主要有抗血管生成、调节机体免疫、诱导肿瘤细胞凋亡、抗多药耐药及抑制端粒酶活性等方面〔4〕。细胞凋亡功能异常与肿瘤的发生发展密切相关〔5〕。近年来，随着认识的深入发现与肿瘤细胞凋亡相关的基因、蛋白并不少，而Survivin、c-myc是其研究的热点。Survivin属凋亡抑制蛋白家族成员，是迄今为止发现的最强凋亡抑制因子，不但可直接或间接地抑制凋亡终末效应蛋白caspase的活化阻止细胞凋亡，还可与纺锤体纤维结合，保护细胞有丝分裂的完整性，抑制细胞的凋亡〔6〕。c-myc基因参与细胞增殖、分化和凋亡的调控，c-myc蛋白表达升高使细胞信号转导和凋亡发生变化，导致细胞发生恶性转变，是肿瘤发生发展的关键因子〔7〕。而端粒酶是一种能增加染色体末端5-TTAGGG-3 重复序列的核糖核蛋白酶复合物，其活性增高可引起细胞发生非正常凋亡，影响细胞寿命，与肿瘤细胞增殖平衡失调、凋亡密切相关〔8〕。

健脾散结方中黄芪、党参具有健脾益气之功，莪术、全蝎、蜈蚣具有散结消积之效，陈皮、半夏、白花蛇舌草可清热解毒，方以黄芪为君，莪术为臣，余为佐药，全方配伍精当，共奏健脾散结之效。且方中八味药物在现代药理研究中也表现出不同程度的抗肿瘤作用，例如莪术可诱导肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤细胞分裂，具有广谱的抗肿瘤活性〔9〕。结合肺癌患者临床多见食欲差、厌食等脾胃症状，以及化疗过程中的消化道反应等也同样印证了健脾以培土生金在肺癌治疗中的重要作用。研究结果提示健脾散结方与顺铂联合有协同作用。说明健脾散结方可抑制凋亡蛋白Survivin、c-myc的表达，其可通过抑制肿瘤细胞的增殖分化诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。随着细胞分裂次数的增加，端粒可进行性缩短，缩短到一定程度则会失去分裂增殖能力〔10〕，提示端粒酶活性越强，抗凋亡作用越明显，而健脾散结方可抑制端粒酶活性，从另一层面说明其可通过影响端粒调节细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡。

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9刘春英，王哲，郝宏党，等.肺癌平诱导Lewis 肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡的形态学研究〔J〕.中国实验方剂学杂志，2005;11(2)：46-8.

10卢宏达，孔庆志，雷章，等.端粒双靶点抑制对肺癌细胞A549 衰老的影响〔J〕.肿瘤防治研究，2013；40(5)：434-5.

〔2014-09-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：王秀娟(1984-)，女，医师，硕士，主要从事中西医结合治疗肿瘤的临床与基础研究。

中图分类号〔〕R734〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6660-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.008