葡萄籽原华青素对慢性间歇性低氧大鼠空间工作记忆和5-羟色胺的影响

乔　娇　赵雅宁　李建民

(河北联合大学康复医学院 ，河北　唐山　063000)



葡萄籽原华青素对慢性间歇性低氧大鼠空间工作记忆和5-羟色胺的影响

乔娇1赵雅宁李建民

(河北联合大学康复医学院 ，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探讨葡萄籽原华青素(GSP)对慢性间歇性大鼠空间工作记忆和5-羟色胺(5-HT)的影响。方法80只健康雄性SD大鼠随机分为：对照组、模型组、GSP低剂量组(100 mg/kg)、GSP高剂量组(200 mg/kg)，每组20只。对照组暴露于空气中，模型组暴露于低氧条件下(50 ml/L)，暴露时间每天8 h，持续4 、8 w；应用HE染色观察脑组织形态变化；Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力；用高效液相色谱法测定损伤大脑皮质内5-HT的含量。结果与对照组比较，模型组皮质区存活神经细胞数量减少，5-HT的含量明显降低(P<0.05)；水迷宫测试结果显示动物潜伏期明显延长，穿台次数明显减少(P<0.05)。与模型组比较，GSP组皮质区存活神经细胞数量增多，5-HT的含量明显增多，水迷宫检测动物逃避潜伏期时间缩短、穿台次数增多(P<0.05)；上述变化在高剂量GSP组最为显著(P<0.05)。结论GSP可增加5-HT的含量、改善间歇性低氧大鼠空间工作记忆能力。

关键词〔〕葡萄籽原华青素；间歇性低氧；5-羟色胺；空间工作记忆

1四川省妇幼保健院

第一作者：乔娇(1982-)，女，护师，硕士，主要从事急危重症护理学和护理教育研究。

工作记忆是指大脑对信息进行短暂储存及加工处理的过程；空间记忆是工作记忆的一种，是日常生活中最为重要的认知功能之一，能帮助个体对周围环境中的物体进行定位或是学习路线〔1〕。阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS) 可造成患者记忆障碍以及出现执行能力和运动协调方面的认知问题〔2，3〕。5-羟色胺(5-HT)是脑内重要的神经递质，与许多功能调节有关，诸如睡眠、性行为、情感行为以及学习和记忆等〔4〕。原花青素(GSP)是天然植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，以葡萄籽中含量最为丰富。研究表明葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、清除自由基、心血管保护、降血脂、抗肿瘤等功能〔5，6〕，但目前有关GSP对睡眠呼吸暂停造成工作记忆的研究，少见报道。本研究采用浓度结合时间切换的方式模拟临床睡眠呼吸暂停状态的低氧，建立慢性间歇性缺氧模型，探讨GSP对间歇性低氧大鼠空间记忆与5-HT的影响。

1材料和方法

1.1实验动物、试剂及仪器雄性SD大鼠80只(中国医学科学院实验动物研究所动物资源中心提供，实验动物合格证编号：0127011)，体质量210～230 g；测氧仪(建德市梅城电化分析仪器厂)；低氧控制程序(河北联合大学医院呼吸科)；纯氮(唐山六方气体高科技有限公司)；低氧舱(天津医科大学研制)。GSP由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供；SABC试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2动物分组和模型制备80只雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组，高、低剂量GSP干预组，每组20只。模型组：模拟临床呼吸暂停事件，建立OSAHS模式间歇低氧动物模型：每天8：00am～4：00pm将实验动物置于模型舱内，向舱内循环充入氮气和空气，每次循环2 min，连续给予氮气30 s，维持舱内氧浓度最低至5%(50 ml/L)，随后均复氧至氧浓度21%(210 ml/L)。对照组持续充入压缩空气。用数字测氧仪监测舱内氧浓度变化，使舱内氧浓度维持在各自的氧浓度内，使其氧浓度波动范围在±0.5%以内；每天实验8 h，实验持续时间为2 w和6 w。GSP组在动物进入低氧模型舱前2 w开始每天灌胃给药1次，持续给药8 w，高、低剂量分别为200、100 mg/kg。对照组暴露于正常空气中；分别在实验第2周和第6周进行所设指标检测。

1.3脑组织形态结构观察病理组织学检测各时间点4%多聚甲醛灌注固定后取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织，常规石蜡包埋。Leica石蜡切片机连续冠状切片，片厚5 μm，苏木伊红染色(HE)染色。在有测微尺的光学显微镜(200×)下观察额叶皮质区神经元形态变化并计数该视野下的存活神经元数量(有明显细胞膜、细胞核、核仁为存活神经细胞)。具体方法：将每个标本取4张切片，在额叶皮质区随机选取4个视野，在有测微尺的光学显微镜(200×)下观察额叶皮质区阳性细胞变化并计数(200×)倍视野下的阳性细胞数量，以每个视野下平均细胞百分率(200×下皮质区存活细胞数量与总细胞数量比值%)表示。

1.4色谱柱检测脑内5-HTHPLC Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保护柱DIKMA(4 mm×8 mm，5 μm)。柱温20℃，流动相选用柠檬酸、柠檬酸三钠、甲醇-离子对试剂-EDTA-Na2混合液(pH4.2)，经过滤后梯度洗脱。取冻存大鼠脑皮层准确称重，用预冷的高氯酸(内含0.15 μg/ml的DHBA)制备10%的组织匀浆，离心15 min，上清液过滤后取10 μl手动进样，在上述色谱条件下，采用内标法测定5-HT含量以ng/g脑组织湿重表示，样本处理液：0.01%半胱氨酸+0.2 mol/L高氯酸钠+0.5 mmol/L EDTA。

1.5记忆功能检测Morris水迷宫是目前国内外研究中广泛应用的检测空间学习记忆功能最精确、客观的一种方法。实验时，将安全岛置于水迷宫第二象限中，加水至高过安全岛2～3 cm，水温保持在22℃～25℃，由摄像机及计算机自动跟踪、拍摄和统计大鼠分别由四个象限入水后寻找到安全岛的轨迹、潜伏值和穿台次数。如在90 s内未找到安全岛，则潜伏期值记为90 s。在规定时间点处死前晨起训练5次后，分别在上午、下午各测试3次，共6次纳入统计，记录各组大鼠逃避潜伏期时间及撤去平台后动物穿越原平台位置的次数，取总均值。

2结果

2.1GSP对慢性间歇性低氧大鼠空间记忆能力的影响与对照组相比，模型组动物的大鼠逃避潜伏期时间均延长、穿越原平台位置的次数均减少；与模型组组比较，GSP组能显著缩短大鼠逃避潜伏期时间、增加原平台位置的次数(P<0.05)。见图1，表1。

2.2GSP对慢性间歇性低氧大鼠皮质区神经细胞形态结构的影响对照组大鼠大脑皮层结构完整，细胞排列整齐。模型组大鼠在间歇性低氧2 w、6 w均可见变性坏死的神经元，神经细胞胞体收缩呈三角形，胞质嗜色性减弱，核皱缩浓染，细胞周围出现空隙；视野内可见有核溶解及神经元细胞空泡样变，细胞间隙显著增宽，存活神经元密度均明显减少(P<0.05)；GSP组中皮质区神经元结构损伤减轻，大部分细胞结构完整，存活神经元细胞存活密度显著增加(P<0.05)。见图2。

2.3GSP对慢性间歇性低氧脑组织5-HT含量的影响与对照组相比，模型组大鼠脑皮质中5-HT含量显著降低(P<0.05)。与模型组相比较，GSP组中脑组织5-HT含量都有不同程度升高(P<0.05)。见表2。

图1各组大鼠空间记忆能力表

组别逃避潜伏期(s)2w6w穿台次数2w6w对照组12.65±2.5512.21±2.6011.57±2.1810.94±2.40模型组36.84±11.351)44.20±4.661)4.62±1.251)3.10±0.921)低剂量GSP组28.93±9.481)2)36.04±4.951)2)5.81±1.601)2)6.32±1.121)2)高剂量GSP组20.76±2.021)2)3)22.86±3.181)2)3)7.68±1.611)2)3)9.22±1.181)2)3)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.05；与低剂量GSP组比较：3)P<0.05，下表同

图2各组大鼠6 w后皮质区神经元形态变化(HE，×400)

组别存活神经元密度(%)2w6w含量5-HT(ng/g)2w6w对照组99.4±0.699.2±0.844.2±8.5542.65±10.49模型组63.5±22.71)54.7±33.81)28.27±4.861)22.67±4.321)低剂量GSP组74.4±21.81)2)62.2±20.61)2)33.78±5.971)2)30.69±5.261)2)高剂量GSP组82.5±17.21)2)3)74.7±19.41)2)3)47.93±7.791)2)3)38.43±5.531)2)3)高剂量GSP组20.76±2.021)2)3)22.86±3.181)2)3)7.68±1.611)2)3)9.22±1.181)2)3)

3讨论

工作记忆包括负责加工位置、距离等空间信息的视空间模板和处理语音方面的信息语音环路以及中央执行系统，其核心是系统位于前额叶〔7〕。神经影像学显示OSAHS患者大脑的多个部位和功能区受损如大脑皮质灰质丢失，海马区在内的脑实质萎缩等；应用事件相关电位事件评测睡眠呼吸暂停患者，发现反应信息加工事件电位N270电位(前额及枕部)波幅降低，患者工作记忆降低〔8，9〕。本研究结果显示GSP可改善睡眠呼吸暂停模式低氧导致的工作记忆损伤。研究认为睡眠呼吸暂停造成的间歇性低氧类似于缺血再灌注，可造成脑内生成大量氧自由基，导致神经细胞结构损伤、丢失，引起记忆功能损害〔10〕；而GSP抗氧化能力极强，是维生素E(VitE)的50倍、VitC的20倍，与SOD相当〔11〕，因此可改善睡眠呼吸暂停大鼠记忆能力，能增强其信息的获取、加工及保持能力。

5-HT是脑内存在的一种重要的神经递质，对记忆的调节以及脑功能的维持有重要作用。Mazer等〔12〕给成年大鼠脑中灌注酪氨酸羟化酶抑制剂-对氯苯丙氨酸以耗竭5-HT，结果出现大鼠学习能力缺损。学习记忆能力下降的大鼠其脑内5-HT亦显著降低〔13〕。研究发现迷迭香对血管性痴呆大鼠学习记忆功能有改善作用；且这种作用与脑内5-HT的改变有关〔14〕。目前临床资料已经证实睡眠呼吸暂停患者体内5-HT水平发生变化，且这种变化与病情的严重程度相关〔15〕。本研究发现随间歇性低氧时间的延长，动物脑内5-HT的含量降低，说明5-HT参与睡眠呼吸暂停模式间歇性低氧对中枢神经系统的病理进程。研究认为〔16〕睡眠呼吸暂停模式的间歇缺氧造成的反复缺氧后再复氧，可引起神经细胞能量代谢障碍、氧自由基损伤，导致单胺类神经递质5-HT等合成和摄取，释放紊乱，脑实质神经细胞内5-HT降低。本研究中，给予GSP干预后，5-HT明显改善，其表达水平呈剂量依赖式显著增加，说明GSP对睡眠呼吸暂停间歇性低氧大鼠脑内5-HT水平有一定调节作用。这可能是GSP对OSAHS致工作记忆损伤的机制之一。

参考文献4

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12Mazer C，Muneyyirci J，Taheny K，etal.Serotonin depletion during synaptogenesis leads to decreased synaptic density and learning deficits in the adult rat：a possible model ofneurodevelopmental disorders with cognitive deficits 〔J〕.Brain Res，1997；760：68-73.

13李训军，严家川，潘峰，等.REM睡眠剥夺对大鼠额叶皮质5-HT的含量及学习记忆的影响〔J〕.重庆医学，2009；38(10)：1151-4.

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16钟益珏，张成，王广发.5-羟色胺2受体激动剂及拮抗剂对大鼠睡眠呼吸暂停的影响〔J〕.中华结核与呼吸杂志，2010；33(5)：350-3.

〔2014-08-07修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

《中国老年学杂志》被国际数家数据库、检索性期刊检索机构收录情况

根据国际检索机构给中国科学技术期刊编辑学会国际交流工作委员会、中国高等学校自然科学学报研究会对外联络委员会发来的电子邮件及其附件统计整理, 《中国老年学杂志》2009年又被4种国际重要检索系统列为来源期刊:

1)美国化学文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波兰《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科学技术社(中国文献数据库)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美国《乌利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/;

5)美国《剑桥科学文摘：生物科学》(CSA：BS)。

通讯作者：赵雅宁(1974-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事老年病学研究。

基金项目：河北省教育厅重点资助项目(No.ZH2012046)

中图分类号〔〕R364.4〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6722-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.034