Treg和Th17细胞在老年原发性非小细胞肺癌患者外周血中的失衡表达及临床意义

潘旭东　毛燕青　陈思文　王　翎　张光波

(苏州大学附属第一医院博习诊疗中心，江苏　苏州　215031)



Treg和Th17细胞在老年原发性非小细胞肺癌患者外周血中的失衡表达及临床意义

潘旭东毛燕青陈思文王翎张光波1

(苏州大学附属第一医院博习诊疗中心，江苏苏州215031)

摘要〔〕目的探讨外周血中Treg、Th17的表达与老年原发性非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展的关系。方法应用四色免疫荧光标记流式细胞术对65例老年NSCLC患者(老年肺癌组)外周血中Treg、Th17的表达量进行检测，并分别与老年良性病变组(老年非癌组)、老年健康组以及年轻健康组对比，并研究其与老年肺癌临床病理特征之间的关系。结果老年肺癌组Treg、Th17的表达量显著高于其余各组(P<0.05)，两者在老年非癌组中表达与老年健康组比较差异均不显著(P>0.05)；老年健康组Treg的表达量显著高于年轻健康组(P<0.05)，而Th17的表达量在老年健康组与年轻健康组间无统计学差异(P>0.05)；两者表达水平与老年肺癌的临床TNM分期、细胞分化程度以及淋巴结转移状态密切相关(P<0.05或P<0.01)，而与病理类型无关(P>0.05)。结论Treg、Th17细胞的失衡表达在老年原发性NSCLC的形成和演变过程中发挥着重要作用。

关键词〔〕非小细胞肺癌；Treg细胞；Th17细胞

1江苏省临床免疫研究所

第一作者：潘旭东(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事老年肺癌及免疫衰老的基础与临床研究。

研究表明，免疫系统在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用，但相关机制仍不十分明确。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要方式，T细胞又在细胞免疫中发挥着核心作用，有关CD8+T细胞识别和清除肿瘤细胞的作用目前已达共识，而CD4+T细胞在肿瘤免疫中尚未得到充分认识〔1〕。Treg是具有免疫抑制功能的一群T细胞，在维持机体免疫平稳、免疫耐受方面起着重要作用。促炎性Th17和抑制性Treg的平衡有利于机体免疫稳态的维持，失衡可引起局部或全身免疫应答异常，对炎症性疾病、自身免疫病、移植排斥反应等均产生重要影响〔2～4〕，但这种失衡是否也在肿瘤免疫中存在目前相关报道甚少。本文旨在探讨外周血中Treg、Th17细胞的表达失衡与老年人肺癌的内在联系及可能机制。

1对象和方法

1.1研究对象初次入院未经治疗的老年(≥60岁)原发性非小细胞肺癌(NSCLC)患者(老年肺癌组)65例，其中男45例，女20例，年龄60～80〔平均(67.4±5.3)〕岁，均经手术、气管镜或经皮肺穿刺活检术病理确诊，其中鳞癌28例，腺癌25例，大细胞癌9例，腺鳞混合癌3例；按照国际抗癌联盟(UICC)临床TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期23例，Ⅳ期16例；另设同期对照组三组，其中老年良性病变组(老年非癌组)30例，男21例，女9例，为肺部感染、错钩瘤以及炎性假瘤患者，年龄60～79〔平均(67.98±6.25)〕岁；老年健康体检者(老年健康组)30例，男18例，女12例，年龄61～80〔平均(68.6±4.9)〕岁；年轻健康体检者(年轻健康组)30例，男16例，女14例，年龄28～51〔平均(39.4±9.0)〕岁。所有参与对象均无感染、糖尿病或自身免疫性疾病，也未使用任何影响免疫系统功能的药物。

1.2研究方法所有患者均于住院后次日晨空腹采血，体检者于体检当日晨空腹抽取外周血2 ml用乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝。CD4+CD25+CD127lowTreg细胞检测：取两支试管各加入100 μl肝素抗凝全血，一管加入10 μl anti-CD4-PC5、20 μl anti-CD25-FITC、20 μl anti-CD127-PE，另一管加入anti-CD4-PC5、鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE各10 μl作为同型对照，室温避光孵育15 min，加入1 ml溶血素15 min后离心弃上清液，加入500 μl磷酸盐缓冲液(PBS)混匀后上机检测。Th17细胞检测：取抗凝全血150 μl与等体积RMPI1640混合，加入7.5 μl浓度为1 μg/ml的PMA、6 μl浓度为50 μg/ml的IO及6 μl浓度为0.5 mg/ml的BFA工作液，使其终浓度分别为25 ng/ml、1 μg/ml、10 μg/ml，放入培养箱中在37℃、5%CO2条件下培养5 h，继之加入10 μl anti-CD4-PC5室温避光反应15 min，再加入等体积A液(8%多聚甲醛)室温避光反应15 min固定，加入1 ml PBS离心洗涤，弃上清液加入等体积B液(皂素)破膜分成两管，第一管加入鼠抗人IgG1-PE、IgG1-FITC各10 μl作为同型对照，第二管加入鼠抗人anti-IL-17-PE 10 μl，避光反应15 min后，再分别加入1 ml PBS离心洗涤，弃上清液，加入500 μl PBS混匀后上机检测。每个样本分析5 000个CD4+细胞，采用Cell Quest分析软件对结果进行分析，以在CD4+T细胞百分比表示。

1.3统计学方法采用SAS8.0统计软件包进行t检验，多组均数间的比较采用方差分析，两两比较采用SNKq检验。

2结果

2.1各组外周血Treg、Th17表达量的比较老年肺癌组外周血中Treg、Th17的表达量明显高于老年健康组、老年非癌组以及年轻健康组(P均<0.05)；而老年非癌组与老年健康组比较，两者表达均无统计学差异(P>0.05)。老年健康组Treg的表达量显著高于年轻健康组(P<0.05)；而Th17表达量在老年健康组与年轻健康组中无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2老年肺癌组外周血Treg、Th17的表达量与肺癌生物学行为之间的关系 随着病程的进展和加重，老年NSCLC患者外周血Treg、Th17的表达水平逐渐增高，其中Ⅲ～Ⅳ期病例高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，低分化癌者高于中高分化癌者(P<0.01或P<0.05)，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P<0.01)；而不同病理类型肺癌之间比较，均无统计学差异(P>0.05)，其中因腺鳞混合癌样本含量较少(3例)，考虑其样本均数可信度较差，故未作统计学分析。见表2。

组别nTregTh17老年肺癌组656.96±1.061)2)4.48±1.111)2)老年非癌组305.93±0.801.74±0.62老年健康组305.89±0.931.67±0.52年轻健康组304.17±0.821)2)1.89±0.57F/P值59.52/<0.0001129.77/<0.0001

与老年健康组比较:1)P<0.05；与老年非癌组比较：2)P<0.05

肺癌临床特征nTregTh17临床分期 Ⅰ～Ⅱ期265.99±0.983.91±0.65 Ⅲ～Ⅳ期397.34±0.951)4.85±1.071)病理类型 鳞癌286.85±1.164.45±1.02 腺癌256.97±0.694.69±1.09 其他127.16±1.224.35±1.15分化程度 中高分化356.31±0.874.18±0.92 低分化307.72±0.721)4.82±1.052)淋巴结转移 无256.11±0.783.96±0.93 有407.49±0.851)5.10±0.961)

相同临床特征之间比较：1)P<0.01,2)P<0.05

3讨论

Th17是一种新型CD4+效应T细胞，具有独立的分化和发育调节机制，能通过分泌IL-17、IL-21等多种炎性细胞因子介导自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应的发生发展，是近年来免疫学研究中的一个热点。有研究表明,与健康人相比胰腺癌患者外周血中Th17细胞的比例明显增高〔5〕,而结直肠癌患者肿瘤组织内Th17细胞比例也明显高于非肿瘤组织内水平〔6〕。Th17数量的增加势必引起效应性细胞因子的分泌，而作为其主要效应细胞因子的IL-17可以上调成纤维细胞的血管内皮生长因子(VEGF)并诱导成纤维细胞中新血管生成而促进肿瘤生长〔7〕。本实验结果提示Th17在老年肺癌的发生发展中可能起重要作用。

Treg是体内存在的另一类功能独特的CD4+T淋巴细胞亚群，它能够分泌lL-4、IL-10和转化生长因子(TGF)-β，对效应T淋巴细胞具有抑制作用，在机体免疫系统中发挥免疫负向调节作用。研究发现低表达CD127的CD4+CD25+T细胞才是真正的调节性T细胞〔8〕，因此，同时检测CD4+、CD25+和CD127low这3个指标，可以更精确地定义Treg细胞群体。本实验结果表明Treg细胞在老年肺癌的发生发展中可能起关键作用。Treg细胞除了通过抑制CD4+T细胞的增殖来破坏了T淋巴细胞亚群之间的平衡外，还可以通过分泌IL-10来抑制细胞免疫的功能，IL-10增高可促进肿瘤细胞逃避免疫监视〔9〕。

Th17和Treg来源于共同的初始T细胞，虽在不同的细胞因子环境下分化而成，但两者的分化均依赖于TGF-β，低浓度的TGF-β在IL-6的协同作用下能诱导Th17转化因子ROR-γt的产生,使活化的初始CD4+T细胞分化为促炎的Thl7；而高浓度的TGF-β却抑制了ROR-γt的表达和功能，并能上调Treg转录因子PoxP3的表达进而分化为抗炎的Treg〔10〕。因此，促炎性Th17与抑制性Treg在分化上的相互抑制导致其功能上也存在相反作用〔11〕，两者间的平衡对于维持免疫内环境的稳定至关重要。本研究发现，在老年肺癌外周血中Th17和Treg没有出现此消彼长的情况，而是同步升高，且均与临床TNM分期、肿瘤细胞分化程度以及淋巴结转移状态密切相关，提示Treg与Th17之间相互作用可能下调了机体的免疫功能，从而促进了肿瘤免疫逃逸的发生发展。但具体机制尚不清楚，有待进一步深入研究。另外，本研究还发现，Treg的表达量在老年健康组较年轻健康组显著升高，提示Treg在免疫衰老中起着重要作用，这与文献报道基本一致〔12〕。但Th17的表达量在这两组中并无明显统计学差异，这也许是老年人对于感染、肿瘤等疾病易感，自身免疫性疾病的发病率较低的原因之一。Treg具有免疫无能性和免疫抑制性，其伴随增龄而增多势必引起机体免疫功能的低下，削弱了机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫攻击能力，从而产生肿瘤免疫逃逸，最终导致机体对于肿瘤易感。肿瘤细胞又可分泌TGF-β、IL-10，从而诱导肿瘤微环境中的初始CD4+CD25+T细胞转化为Treg，肿瘤细胞表达趋化因子CCL22，促使高表达CCL22受体CCR4的Treg迁移到肿瘤微环境，Treg又在肿瘤微环境中发挥了免疫抑制作用〔13〕，二者相关协同更加促进老年肺癌的发生和进展。呈增龄性改变的Treg可导致机体免疫衰老，同时也可导致肿瘤发病率增高，推测免疫衰老与肿瘤免疫可能存在某些共同调控机制。因此，对于Treg细胞进行检测及调控可为衰老及肿瘤的免疫监测、免疫治疗提供一定科学依据。

参考文献4

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11Bettelli E,Carrier Y,Gao W,etal.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells〔J〕.Nature,2006;441(7090):235-8.

12Pan XD,Mao YQ,Zhu LJ,etal.Changes of regulatory T cells and FoxP3 gene expression in the aging process and its relationship with lung tumors in humans and mice〔J〕.Chin Med J(Engl),2012;125(11):2004-11.

13Ishida T,Ueda R.CCR4 as a novel molecular target for immunotherapy of cancer〔J〕.Cancer Sci,2006;97(11):1139-46.

〔2015-02-17修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：王翎(1964-)，女，教授，博士生导师，博士，主要从事老年呼吸及免疫衰老的基础与临床研究。

基金项目：苏州市“科教兴卫”青年科技项目资助(No.KJXW2012002)

中图分类号〔〕R734.2〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6828-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.083