CD44、CD133及EpCAM与肝癌细胞成瘤性及耐药性的相关性

郑　敏　谢琳娜　曾燕华　林德馨

(福建医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，福建　福州　350108)



CD44、CD133及EpCAM与肝癌细胞成瘤性及耐药性的相关性

郑敏谢琳娜1曾燕华林德馨

(福建医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，福建福州350108)

摘要〔〕目的探讨细胞表面标志物组合与肝癌细胞的成瘤性及其对药物抗性的相关性。方法利用目前广泛用于肝癌干细胞鉴定与分离的三种细胞表面标志物(CD44、CD133和EpCAM)对几种肝癌细胞进行表面标志物表达分析，并通过肿瘤体外移植实验研究细胞成瘤性，用抗癌药索拉非尼处理细胞，观察不同类型细胞的耐药性。结果Hep3B、SK-Hep-1和SNU182这三株细胞具有三种截然不同的细胞表面标志物组合表达模式。CD44阳性与STAT3的激活和细胞对索拉非尼的抗性相关，而CD133/EpCAM双阳性则与低成瘤性相关。结论该研究为肝癌干细胞的组合式分选鉴定的探索提供了新思路。

关键词〔〕细胞表面标志物；肿瘤干细胞；肝癌；索拉非尼

1福建生物工程职业技术学院健康产业研究院食品与生物工程系

第一作者：郑敏(1982-)，男，讲师，博士，主要从事肿瘤生物学研究。

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，五年生存率极低〔1〕。索拉非尼是美国FDA在2007年批准的晚期肝癌的靶向治疗药物〔2,3〕。由于肝癌细胞的高耐药性和转移性，肝癌在术后仍有较高的复发率。目前，已有多种细胞表面标志物被用于从肝癌细胞系甚至是人类肝癌样本中鉴别和分离肿瘤干细胞〔4〕，其中CD133是最早被用于富集和分离肝癌干细胞的表面标志物〔5〕。有研究〔6,7〕指出， CD133+/CD44+和EpCAM+/CD133+细胞群均比其他亚群的细胞具有更强的肿瘤干细胞特征。但是，在其他肝癌细胞中这3个细胞表面标志物与肿瘤干细胞特征的相关性研究尚未见报道。本研究拟探讨CD44、CD133和EpCAM的表达情况与肝癌细胞成瘤性及对索拉非尼耐药性的关系。

1材料和方法

1.1实验材料DMEM(货号SH30022.01B)购自赛默飞世尔公司。胎牛血清(货号100-500)购自Gem Cell TM公司。E-cadherin抗体(货号BD610181)购自BD公司。STAT3-Y705磷酸化抗体(货号ab76315) 购自Abcam公司。gamma-tubulin抗体(货号T6557)购自Sigma公司。β-akt-T308磷酸化抗体(货号9275L)和Erk1/2-T202/Y204(货号4370s)磷酸化抗体购自Cell Signaling公司。β-actin抗体(货号sc-32251)购自Santa Cruz公司。PE耦联的CD133抗体(货号130-080-801)购自Miltenyi Biotec公司。Pacific Blue耦联的EpCAM抗体(货号324218)购自Biolegend公司。大鼠活化蛋白(APC)耦联的CD44抗体(货号17-0441-83)购自eBiosciences公司。SNU182，Hep3B和SK-Hep-1细胞系均由美国哈佛大学卢坤平教授馈赠。细胞培养于含有10%血清的DMEM培养液中，放在含5%CO2的37℃培养箱中培养〔8,9〕。

1.2细胞表面标志物分析收集2×105个细胞，用相应的抗体标记后，流式细胞分析仪进行分析〔10〕。在100 μl标记体系中，EpCAM抗体加入5 μl，CD44抗体加入2 μl，CD133抗体加入4 μl。

1.3体外成瘤实验将5 000个细胞通过皮下注射到裸鼠背部两侧，每种细胞各进行6次生物学重复。每3～4 d检测肿瘤形成情况。肿瘤的体积以长×宽×高计算。

1.4基于Annexin-V/PI染色的细胞凋亡分析将飘起的细胞连同贴壁细胞一同收集。按照Roche公司的Annexin-V-FLUOS染色试剂盒(货号11988549001)的说明对处理细胞进行染色，并用流式细胞仪分析其凋亡情况。

1.5统计学方法应用SPSS19.0软件进行分析。

2结果

图1　CD133和EpCAM在Hep3B、SK-Hep-1和SNU182细胞的共表达分析

2.1CD44、CD133和EpCAM在肝癌细胞表面的表达流式细胞分析技术检测结果显示，Hep3B细胞CD133阳性98.7%、EpCAM阳性97.4%，CD44阳性0.8%；SK-Hep-1细胞中CD133阳性0.4%、EpCAM阳性6.3%，CD44阳性99.3%；在SNU182细胞中，CD44阳性率为99.0%，CD133和EpCAM的阳性率分别为68.2%、7.04%。

其中，超过95%以上的Hep3B和60%的SNU182都是EpCAM、CD133双阳性。因为超过95%的SNU182细胞是CD44阳性，所以这群CD133、EpCAM双阳性的SNU182细胞同时也是CD44阳性细胞。基于上述结果，Hep3B、SK-Hep-1和SNU182分别代表着三种带有不同表面标志物表达方式的细胞。见图1。

2.2CD133+/EpCAM+与低成瘤性相关肿瘤体外移植实验结果显示，在3个月内，SK-Hep-1细胞可形成直径约1 cm的肿瘤，而Hep3B和SNU182均未见肿瘤形成。 综合各个细胞表面标志物的表达情况，这一结果提示CD133、EpCAM双阳性与低成瘤性有关。见图2。

图2　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182细胞体外成瘤实验结果

2.3CD44+与STAT3激活和索拉非尼抗性相关在肝癌中，CD44-STAT3信号通路对于肿瘤细胞的抗凋亡十分重要〔11〕。对上述肝癌细胞内的信号通路分析结果印证，STAT3的磷酸化修饰在CD44阳性细胞(SK-Hep-1和SNU182)中持续激活，而Erk和Akt的磷酸化则没有显著差异。见图3。

图3　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182细胞中STAT3、Erk和Akt活性分析

用10 μmol/L的索拉非尼处理细胞，每隔12 h观察细胞。结果显示，大约60%的Hep3B细胞在处理72 h后飘起，而绝大多数的SK-Hep-1和SNU182细胞仍贴壁。通过基于Annexin-V和pI染色的细胞凋亡分析结果显示，索拉非尼导致的细胞凋亡率在Hep3B中约为56%；在SK-Hep-1中约为11%，而在SNU182细胞中约为21%。由此可见，CD44阳性的SK-Hep-1和SNU182细胞较CD44阴性的Hep3B细胞对索拉非尼有着更加显著的抗性。见图4。

图4　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182对索拉非尼敏感性分析

3讨论

肿瘤干细胞在肝癌的发生、发展和放化疗抗性中发挥着十分重要的作用〔12〕。但是，肝癌干细胞的鉴定无论是在实验室还是临床来说仍然是限制靶向肝癌干细胞的肝癌临床治疗的一个重要瓶颈。 到目前为止，包括CD13〔13〕、CD44〔9〕、CD90〔14〕、CD133〔9,15～17〕、EpCAM〔5〕和ALDH〔13〕在内的多种表面标志物都被用于肝癌干细胞的鉴定和分离。值得指出的是，目前仍然没有公认的肝癌干细胞表面标志物，原因很可能与这些肿瘤表面标志物的细胞特异性有关。以往，肝癌干细胞的表面标志物是在一个特定的细胞系内对不同亚群细胞的肿瘤干细胞特征进行比较后确立的，很少在不同细胞系之间进行比较。 即便是在不同细胞系之间发现差异，通常也被简单地认为是由于细胞系之间不同遗传背景的差异所导致。因而，在不同细胞系间进行细胞表面标志物与肝癌干细胞特征的相关性研究往往被人们所忽略。

本研究发现CD44、CD133和EpCAM在不同细胞系中有着截然不同的组合表达方式。结果提示在肝癌这种异质性程度高的癌症中，CD44、CD133和EpCAM或者是他们中的2个或3个表面标志物的组合并不足以用来普遍地指示肝癌干细胞的所有特征。若将表面标志物进行拆分，结果提示CD44+与STAT3的活性和细胞对索拉非尼抗性呈正相关，而CD133+/EpCAM+则与肝癌细胞的成瘤性呈负相关。这项研究结果受限于细胞系种类的数量，因而在更大范围的肝癌细胞系中对细胞表面标志物与肝癌干细胞特征的相关性研究是十分必要的。 这些结果将有助于对已有的以及新发现的细胞表面标志物进行普遍性评估，以此判定其是否可以作为肝癌干细胞的表面标志物，为靶向肝癌干细胞的临床治疗提供切实可行的潜在靶点。

参考文献4

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4Ji J,Wang XW.Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma〔J〕.Semin Oncol,2012;39(4):461-72.

5Ma S,Chan KW,Hu L,etal.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells〔J〕.Gastroenterology,2007;132(7):2542-56.

6Zhu Z,Hao X,Yan M,etal.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+population in hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer,2010;126(9):2067-78.

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9Fuchs BC,Fujii T,Dorfman JD,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition and integrin-linked kinase mediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells〔J〕.Cancer Res,2008;68:2391-9.

10Zheng M,Wang YH,Wu XN,etal.Inactivation of Rheb by PRAK-mediated phosphorylation is essential for energy-depletion-induced suppression of mTORC1〔J〕.Nature Cell Biol,2011;13(3):263-72.

11Liu Y,Li PK,Li C,etal.Inhibition of STAT3 signaling blocks the anti-apoptotic activity of IL-6 in human liver cancer cells〔J〕.J Biol Chem,2010;285(35):27429-39.

12Rountree CB,Mishra L,Willenbring H.Stem cells in liver diseases and cancer:recent advances on the path to new therapies〔J〕.Hepatology,2012;55(1):298-306.

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〔2014-10-27修回〕

(编辑袁左鸣)

Correlation of CD44,CD133 and EpCAM with tumorigenicity and sorafenib resistance of liver cancer cells

ZHENG Min,XIE Lin-Na,ZENG Yan-Hua,etal.

Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University,Fuzhou 350108,Fujian,China

【Abstract】ObjectiveTo study the correlation of cell surface markers with tumorigenicity and sorafenib resistance in liver cancer cells.MethodsThe expressions of three wildly used surface markders (CD44,CD133 and EpCAM) were tested,xenograft based tumorigenicity and sorafenib sensitivity in several liver cancer cell lines were analyzed.ResultsHep3B,SK-Hep-1 and SNU182 cells were correlated with totally different surface-expression phenotypes. CD44+highly were correlated with STAT3 activation and sorafenib resistance,while CD133+/EpCAM+was associated with low cellular tumorigenicity.ConclusionsThis study might help define cell surface markers combinational pattern for identifying liver cancer stem cells.

【Key words】Surface markers；Cancer stem cells；Liver cancer；Sorafenib

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(31100995)；福建省中青年教师教育科研项目(JA14410)；福建省高校杰出青年科研人才项目(JA14129)

中图分类号〔〕R735〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23--；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.011