八棱海棠茎段的组织培养*



八棱海棠茎段的组织培养*

郑志新1，张小红1,李艳丽1,霍书新1,张丽娟2

(1.河北北方学院 园艺系，河北张家口075131；2.承德市平泉县农牧局，河北承德067500)

摘要：为了建立八棱海棠的组织培养快繁体系，以八棱海棠单芽茎段为外植体，以MS为基本培养基进行组织培养研究。结果表明，5月为单芽茎段外植体获取的最佳时间，此时污染率低，死亡率低；最佳丛生芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导率为53.2 %； MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L为最佳增殖培养基，暗培养2周，增殖系数为4.73；生根培养以1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L较好，平均根长为5.2 cm，生根率为90.0 %。

关键词：八棱海棠；单芽茎段；组织培养；暗培养

八棱海棠(Malusrobusta)又名怀来海棠，属蔷薇科苹果属，西府海棠种。落叶乔木，树冠开张，树高可达5～7 m，为苹果的常用砧木。八棱海棠花5～12朵簇生，单个花体直径2～2.5 cm，4月份开花，刚出的花骨朵呈红色，慢慢地开展由红色变粉红色，渐渐地再由粉红色变为粉白色，树上花朵密密层层，十分壮观；八棱海棠自花授粉，坐果率极高，充分成熟后，色泽鲜红夺目，红里透紫，观赏效果极佳。

八棱海棠一直采用实生繁殖，后代常发生变异，有众多的具较强抗性或观赏性的优良单株急需筛选、培养，加速繁殖。组织培养技术可迅速建立无性繁殖体系，周年育苗，规模大、周期短，不受季节的限制，为优良单株的快速繁殖提供了一条高效途径[1]。迄今，八棱海棠主要作为苹果属植物的砧木存在，对其研究也主要集中在种子处理及嫁接育苗上[2～3]。李文然[4]、孙爱军[5]等都对八棱海棠的组织培养进行过相关的研究，但都没有形成完整的体系。因此研究八棱海棠组培快繁技术，对八棱海棠选优、利用和发展有深远的意义。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为6年生八棱海棠实生苗的1年生枝条。将枝条切成5 cm茎段，流水冲洗2 h，在超净工作台上用75 %乙醇浸30 s，放入0.1 %升汞(HgCl2)溶液中，浸8-12 min，倾去升汞液，用无菌水冲洗5～6次，切成1～1.5 cm长的单芽茎段接种到诱导培养基上。培养室光强为2 000 Lx，光照16 h/d，温度23±2℃。

1.2研究方法

取材时间的筛选分别于5月、6月、7月、8月和9月采集八棱海棠枝条，接种在诱导培养基上，调查污染率和死亡率，筛选八棱海棠单芽茎段组培适宜的外植体采集时间。

诱导培养诱导培养以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)和NAA(0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L)。每瓶接种3茎段，每处理接种10瓶，30天后统计各处理的芽诱导率。

增殖培养将诱导培养的幼芽接种在增殖培养基中，每瓶接种幼芽3个，每处理10瓶。增殖培养基以MS为基本培养基，处理A、B、C添加不同浓度的6-BA(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)，NAA浓度为0.2 mg/L；处理D(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)为转接后暗培养2周，然后正常光照培养，统计各处理芽的平均高度、增殖系数。

生根培养选取2～3 mm长的芽接种于生根培养基中，生根培养基选用1/2 MS培养基，蔗糖浓度为2.0 %，分别附加不同浓度的IBA(0 mg/L、0.3 mg/L)和NAA(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L)。每瓶接种3块，每处理接种10瓶。30天后统计各处理的平均根长和生根率。

2结果与分析

2.1取材时间的筛选

分别在5月、6月、7月、8月和9月采集八棱海棠新梢的单芽茎段进行诱导培养，随着枝条木质化程度增加，外植体上可能携带污染物也增加，HgCL2处理时间也随之增加。接种30天后污染率和死亡率结果见表1。

表1　不同取材时间外植体污染率和死亡率比较

注：污染率=污染的外植体块数∕接种外植体块数×100%,死亡率=死亡的外植体块数∕(接种外植体块数-污染外植体块数)×100%。

由表1可知，死亡率最高的是9月采集的外植体(HgCl2处理12 min)，死亡率达100 %；污染率最高的是8月采集的外植体(HgCl2处理10 min)，污染率为27.8 %，其次是7月采集的外植体(HgCl2处理10 min)，污染率为26.6 %，这可能是外植体所携带的病菌增多而灭菌时间相对较短导致的。最佳外植体采集时间是5月(HgCl2处理8 min)，污染率和死亡率都最低，分别为13.3 %和7.6 %。八棱海棠外植体接种后培养基很快变褐色(图1)，转接1次后，未出现褐化现象(图2)。6月和9月接种的外植体褐化严重，7-8月的褐化现象相对较轻，而5月培养的八棱海棠外植体褐化现象不明显。

图1　外植体褐化现象明显

2.26-BA和NAA浓度对丛生芽诱导培养的影响

将没有污染和死亡的八棱海棠单芽茎段转接到诱导培养基上进行诱导培养，所设培养基及诱导结果见表2。由表2可知，6-BA浓度一定时，随着生长素浓度的增大，芽诱导率下降，当NAA浓度达到1.0 mg/L时，没有芽被诱导出来，但有大量愈伤组织形成(图2)，可见高浓度生长素对八棱海棠的芽诱导起到了抑制作用，而对愈伤组织的诱导具有一定促进作用。细胞分裂素6-BA为1.0 mg/L，NAA为1.0 mg/L时，芽诱导效果最好，达到了53.2 %(D处理，图3)，随着6-BA浓度升高，芽诱导效果开始下降。丛生芽诱导培养结果表明，最适宜的八棱海棠丛生芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表2　6-BA和NAA浓度对丛生芽诱导培养的影响

注：芽诱导率=(出芽外植体块数/接种外植体总块数)×100%。

图2　高浓度生长素形成的愈伤组织

图3　低浓度生长素诱导形成的不定芽

2.36-BA浓度和暗培养对增殖培养的影响

提高生长素浓度(NAA 0.2 mg/L)进行增殖培养,40天后统计结果(表3)。由表3可知，处理A的增殖系数最低，只有1.84，但是平均芽高却达到了3.41 cm，处理D的增殖系数为4.73，平均芽高3.21 cm，与处理B、C之间存在显著性差异。处理B、C二者之间的平均芽高和增殖系数之间均无显著性差异，但其增殖系数均与处理A之间存在显著性差异，其平均芽高显著低于处理A，而增殖系数显著优于处理A。试验结果表明，暗培养2周后，有大量愈伤组织出现，转正常光照培养后，大量丛生芽出现(图4)，说明一段时间的暗培养对于八棱海棠愈伤组织的增殖和丛生芽的诱导是极为有利的。

表3　6-BA浓度对增殖培养的影响

注：邓肯氏新复极差测验，表中同列数值后标记不同字母表示差异达0.05显著水平。

图4　暗培养转光照培养后出现大量丛生芽

2.4生根培养

以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的生长素对八棱海棠丛生芽进行生根诱导。20天以后，开始在芽基部出现白色辐射状不定根，30天后统计生根及根系生长情况(表4)。

表4　生长素种类和浓度对生根培养的影响

由表4可知，各处理之间的平均根长为4.2～6.6 cm，以处理4为最长，达到6.6 cm，处理3最短，为4.2 cm。处理1的生根率最低，为66.6 %，处理5的生根率最高，达到了90.0 %，可见八棱海棠丛生芽生根培养时，单一生长素生根效果较混合生长素生根效果相对较差，其中1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L为八棱海棠较适宜的生根培养基。

3结论与讨论

3.1结论

八棱海棠外植体的最佳获得时间为5月(HgCL2消毒8 min)，此时新芽萌发，细胞分裂旺盛，所携带的污染物相对较少，处理相对容易。一定浓度的生长素和细胞分裂素对于八棱海棠的芽诱导有着明显的促进作用，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L效果最佳，诱导率达到53.2 %。暗培养对于愈伤组织增殖和丛生芽诱导有明显促进作用。生长素对于八棱海棠丛生芽的生根有着明显的促进作用，组合生长素的促进作用优于单一生长素，以1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L效果最佳。

3.2讨论

八棱海棠外植体接种后培养基很快变褐色，转接1次后，未出现褐化现象，6月和9月接种的外植体褐化现象严重，这与张庆田等研究结果相同[6]。张庆田等认为植物组织培养过程中，外植体的褐变程度受取材时期、外植体类型和消毒时间影响，随着灭菌时间的延长，所受药害越重，褐变死亡率增加，而存活率降低。

陈宗礼等认为植物芽的诱导取决于内源激素的平衡，外源生长调节剂通过改变内源激素的平衡而产生作用，外加的细胞分裂素及生长素要求达到一定的浓度和比例，才使器官发生达到预期目的[7]。孙爱君等研究发现，新乔纳金(Malusdomestica)的叶片再生频率均以6-BA/NAA的比值为20或10时最高[5]。本项试验结果表明，当NAA浓度达到1.0 mg/L时，6-BA浓度无论为0.5 mg/L、1.0 mg/L或是1.5 mg/L，接种的外植体均不能诱导形成丛生芽，但形成大量愈伤组织；而当6-BA为1.0 mg/L、NAA为0.1 mg/L时，即当6-BA/NAA的比值为10时，八棱海棠外植体的丛生芽诱导率最高(53.2 %)，说明生长素与细胞分裂素之间的比例对丛生芽的诱导具有显著的影响。

师校欣等研究表明，在继代增殖阶段，一段时间黑暗培养可使试管苗生长加快、节间伸长、叶片增长受抑，从而增加有效新梢数量，增加繁殖效率，并且，暗培养时间因品种不同而有所不同[8]。本试验中，暗培养2周，增殖系数由1.84提高至4.73，但不同的黑暗培养时间对八棱海棠增殖系数影响有待进一步研究。

生长素的种类和浓度影响组培苗根系的诱导和生长。古西府海棠(Malusmicromalus)不定根最适诱导培养基为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L，生根率为100 %[9]。日本圆叶海棠(M.prunifoliavar.ringo)生根的适宜培养基为1/ MS+ IAA 0.5 mg/L，生根率达93.3 %，而1/2 MS + NAA 0.5 mg/L，生根率仅为50.0 %。本项研究中，1/2 MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.2 mg/L为八棱海棠较适宜的生根培养基，生根率达90.0 %，其中混合生长素效果优于单一生长素效果，其具体作用机理还有待于进一步研究。

本试验研究的八棱海棠丛生芽诱导、增殖及生根培养所涉及的培养基配方仅在MS基本培养基添加不同浓度的6-BA和NAA、IBA，而其他种类和浓度的生长素和细胞分裂素、其他种类的基本培养基对于八棱海棠茎段组织培养再生体系建立的影响和作用，还需进行更加深入的研究。

参考文献：

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[4]李文然，张志宏，代洪艳.八棱海棠无性系建立[J].沈阳农业大学学报，2013，44(4)：404-408.

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[6]张庆田，夏阳，孙仲序，等.垂丝海棠组培再生体系建立的研究[J].生物技术,2007,17(3)：73-75.

[7]陈宗礼，高彦，刘娜，等.日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖[J].西北农业学报,2010,19(2):183-188.

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Tissue Culture of Malus robusta Stalk Segment

ZHENG Zhi-xin1,ZHANG Xiao-hong1,LI Yan-li1,HUO Shu-xin1,Zhang Li-juan2

(1.Department of Horticulture， Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075131,P.R.China;

2.Pingquan Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Chengde，Chengde Hebei 067500,P.R.China)

Abstract:In order to establish tissue culture rapid propagation for Malus robusta,relevant study was made by taking single-bud stalk segment as explant,and MS as the basic medium.The result shows that the May is the best time for obtaining explant,and both contamination rate and death rate are lowest at that time.MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L is the best culture medium for inducing,and the rate is 53.2 %.MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L is the best culture medium for multiplication,and the coefficient is 4.73 with two weeks dark culture.1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L is appriopriate for rooting culture ,and the average root length is 5.2 cm,while rooting rate is 90.0 %.

Key words:Malus robusta；single-bud stalk segment；tissue culture；dark culture

中图分类号：S 685.99

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2015)06-0038-04

作者简介：第一郑志新(1980-)，讲师，主要从事园林树木栽培及相关生物技术研究。E-mail：zjkzzxin@126.com

基金项目：张家口市科学技术研究与发展项目(1021019C)。

收稿日期：*2015-05-26

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.06.008