针刺对脑卒中后神经干细胞增殖影响的研究进展

张菶，孙晓伟，邹伟*，孙梦娟

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)



针刺对脑卒中后神经干细胞增殖影响的研究进展

张菶1,2，孙晓伟2，邹伟2*，孙梦娟1

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

通过在中国知网、PubMed数据库等网站输入脑卒中、神经干细胞和针刺等关键词查找相关文献，对近年有关神经干细胞的研究进展及针刺对脑卒中后实验动物神经干细胞增殖影响的文章进行综述。认为针刺确实可以促进神经干细胞增殖，并能对受损神经组织进行修复，但其中的机制仍有待研究。

脑卒中；神经干细胞；针刺

脑卒中按病理分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，二者都可引起脑局部血液循环障碍，以致该部位脑组织供血受累而出现相应的症状和体征[1]。近年发现，神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)对脑卒中后受损神经细胞的内源性修复起重要作用。有实验表明，脑卒中发病可诱导脑组织内NSC增殖，但脑卒中所诱导NSC增殖的数量和速度不足以弥补其导致神经细胞坏死的数量和速度[2]。针刺作为一种传统疗法，在治疗脑卒中方面起到积极作用，如在减轻炎症反应、保护血脑屏障、抑制凋亡等方面均有很好疗效。已有研究发现针刺可促进脑卒中后NSC增殖。本文通过综述针刺对NSC的作用，从而为脑卒中的治疗提供新思路。

1 NSC研究进展

1.1 NSC发现

神经元和胶质细胞是构成中枢神经的主要细胞，都由NSC分化而来。起初认为神经元增殖都发生在胚胎期，出生后停止，成年一旦神经元受损，只能靠胶质细胞增殖来弥补。后来发现在成年动物中中枢神经系统内也有新生神经元产生，这也使人们对神经元不能再生的观点产生怀疑。而这些新生细胞又从何而来？1992年，Reynolds等[3]终于在成年小鼠纹状体内分离出了能够自我复制且能分化成神经元和胶质细胞的NSC。1997年，McKay等[4]又对NSC的概念做了高度概括，即NSC是一类具有增殖能力且能分化成神经元和神经胶质细胞的一类细胞群。

1.2 NSC分布、来源

NSC不仅在胚胎期哺乳动物脑组织的大部分区域，如端脑、小脑、海马、嗅球及脑室中大量存在，成年后，仍有少量残存于海马及侧脑室。正常情况下，NSC在成体脑组织内多处于静止状态，它们仅有少量定向迁移并分化到特定区域，而在诸如脑卒中等脑损伤后，NSC快速增殖，并不断向损伤部位迁移、分化，以对该部位进行修复，但单纯通过脑损伤刺激调动NSC是不够的。

神经再生作为获取NSC和神经细胞的重要手段，已成为近年研究热点。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)作为具有多潜能分化特点的全能干细胞，是人们获取NSC的最初办法。80年代初，Evans等[5]首先从小鼠囊胚内获得ESC。而后为了诱导ESC向NSC分化，Bain等[6]将ESC用维甲酸和生长因子处理来获得NSC，但因维甲酸致畸作用等原因，该方法并不适用于临床。若能直接提取哺乳动物神经组织内的NSC并大量扩增，也是获取NSC的好选择。有人试图在发育的胎儿和成体脑内获得NSC，但此方法难度大，而且涉及伦理问题也饱受非议。随着干细胞研究深入，人们不断将神经干细胞谱系之外的多能干细胞诱导成NSC。目前已有大量文献报道骨髓、脂肪等来源的多能干细胞经相应诱导，有分化成NSC的潜能。这些组织在体内含量多，取材简单，还可避免伦理问题，故已成为NSC来源的新选择。如今获取NSC的方法不断更新，2007年，日本学者[7]将4种与细胞多能性相关的基因组合并导入动物成纤维细胞内，获得了iPSC(Induced Pluripotent Stem Cell)，该细胞许多特性与ESC相似，但其诱导能力较ESC低，且植入体内还会激活癌基因。既然人们最终目的是想通过刺激NSC来获得神经细胞，是否可越过NSC的环节直接得到它？成体细胞谱系转换为这一设想提供可能，该技术分为直接转分化和间接转化。前者是将特定转录因子导进某成体细胞，直接将其变为另一种成体细胞，目前胶质细胞及成纤维细胞都能通过这一技术转化为神经元；后者是将某种成体细胞(非神经细胞)先去分化成NSC，再使其分化成神经元[8]。二者可解决NSC获取困难的问题。

1.3 NSC增殖、迁移、分化

NSC的增殖、迁移和分化是一连续过程。它的分裂方式有两种：对称分裂和不对称分裂。前者是一个NSC对称分裂成两个相同的NSC，该分裂方式可保证NSC的不断供给；后者是一个NSC通过不对称分裂，变成一个NSC和一个前体细胞，不同种类的前体细胞可继续分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。成体NSC主要存在于海马及侧脑室下区，正常情况下，这些区域的NSC可少量从各自增殖区向附近靶组织定向迁移、分化，从而形成海马齿状回颗粒细胞下区-粒细胞层系统和脑室下区-头侧突起-嗅球系统。但脑卒中后，NSC会大量向损伤部位迁移，并分化成神经元和胶质细胞，对损伤部位进行修复。而且这一过程还需要多种调节因子及信号通路的参与。

1.4 NSC鉴定

NSC会表达一些特异蛋白作为检测自身的主要指标，目前检测出的蛋白主要有巢蛋白(Nestin)、Musashi-1和SOX-1等。需指出，上述蛋白对于NSC只是相对特异，但因它们在NSC内可高表达，对NSC有高度选择性，因此仍可将它们作为NSC的主要标志物。拿巢蛋白为例，它最早是由Lendahl等发现的、主要分布于神经上皮干细胞质内的一种蛋白。NSC内都有巢蛋白表达，而随着NSC向目的区域迁移并逐渐分化成熟，其表达也逐渐下降，直至消失，因此可以说巢蛋白是鉴定NSC的主要标志之一。但巢蛋白在NSC内大量表达同时，也会在神经组织的其他种类细胞中[9]，甚至在心脏、胰腺等非神经组织中检测到它的存在[10]，所以巢蛋白并非是NSC的特异蛋白，只能说它对NSC有高度选择性[11]。Musashi-1作为一种RNA结合蛋白，可特异性结合m-Numb mRNA并抑制其转录，m-Numb是Notch通路抑制剂，当Musashi-1将m-Numb抑制后，通路即被激活，维持NSC增殖[12]。现发现Musashi-1在NSC和神经前体细胞内高表达，同时它在成体动物消化道及乳腺的表皮干细胞内也有表达[13]。除上述外，一些转录因子和细胞表面黏附因子也可作为鉴定NSC的标志蛋白。

BrdU(5-Bromo-2-deoxyuridine)作为一种细胞增殖标记物，可标记增殖的NSC。大概机制是BrdU可将NSC内DNA的胸腺嘧啶(T碱基)替换出来，再将自己重新整合到DNA内。当NSC增殖时，其子代细胞的DNA也含BrdU[14]。此时即可通过免疫荧光技术，用BrdU一抗和相应荧光二抗将增殖的NSC标记出来。

2 针刺对脑卒中后实验动物NSC表达的作用

针刺作为一种传统中医疗法，在治疗脑卒中方面越来越受到重视。在干细胞技术不断突破的今天，人们同时也注意到针刺对神经再生的作用。不同于体外扩增，针刺可内源性刺激NSC增殖，对人体几乎无创伤和毒副作用。所以多项研究都围绕针刺与NSC增殖方向展开。

2.1 针刺头穴对脑卒中NSC表达作用

中医认为[15]，脑为髓海，为元阳精气所聚，脑与人的神志活动以及肢体活动密不可分。若脑部病变，势必使髓海失充，脏腑经脉失养，出现神志和肢体活动异常。而针刺头穴可振奋阳气、填充髓海，使脏腑经脉得以滋养，从而改善神志异常和肢体不利的症状。现代研究表明，针刺头穴可能通过激活某些促进细胞增殖的通路来发挥激活NSC的作用。同时，针刺头穴还可抑制脑卒中后脑组织内水肿、血肿及炎症的形成，同时也可改善脑部电生理，这为NSC增殖提供良好环境。

李丹等[16]针刺“百会”透“曲鬓”穴观察其对脑出血大鼠巢蛋白表达影响时发现，模型组和针刺组Nestin蛋白都在6 h有表达，2 d达高峰，3 d、7 d逐渐下降，而且针刺组各时间点阳性细胞数较同时间点模型组显著升高。即使3 d、7 d针刺组阳性细胞出现下降，但也明显高于同时间点模型组。说明针刺头穴可以对脑卒中后NSC表达起积极作用。胡科等[17]为研究针刺对脑缺血后大鼠室管膜下区NSC表达的影响，将实验分成模型组、康复训练组和针刺加康复训练组。其中，针刺取百会及其左右各旁开4 mm的部位行针。结果发现，针刺加康复训练组的新生NSC在7 d、14 d、21 d相较同时间点的另外两组有显著提高，结果有统计学意义。此外，吴洪阳等[18]还用针刺百会、前顶、率谷、悬厘等头穴在脑缺血大鼠齿状回观察7 d时间点巢蛋白表达，发现针刺组较正常组、假手术组和模型组相比Nestin阳性细胞数表达最高。

2.2 针刺阳明经穴对脑卒中NSC表达作用

中风发病久卧可致肌肉筋脉痿废失用，阳明乃五脏六腑之海，针刺阳明经穴可润宗筋、利关节，故“治痿独取阳明”[19]。现在发现，针刺阳明经穴不但可促进运动功能恢复，同时也激活脑内NSC表达。

陶静等[20]为研究针刺对脑缺血再灌注大鼠室管膜下区神经干细胞表达影响，将实验分为模型组、针刺组、康复训练组和康复训练加针刺组。选穴为患侧曲池、足三里。结果发现4组新生NSC均在7 d达高峰，随后逐渐下降，其中针刺组与同时间点模型组相比阳性细胞数显著升高。高剑峰等[21]也试图通过针刺肩髃、髀关、足三里等阳明经穴激活脑缺血大鼠神经干细胞表达。结果发现，穴位治疗组在1、3、7、14、21 d五个时间点的新生细胞表达数比同时间点模型组和非穴位组都高，结果有统计学意义。

2.3 针刺任督二脉经穴对脑卒中NSC表达作用

任督二脉与脑之间有着密不可分的关系。首先，任督二脉中，任脉主阴，督脉主阳，二者循环往复，维持着阴阳平衡。而且二者都循行于脑[22]。因此脑的生理活动有赖于任督二脉的正常运行。

杨振等[23]为研究刺督调神法对MCAO大鼠NSC增殖影响，将动物分为模型组、药物组和针刺组，其中针刺组取百会、风府、神庭、水沟。各组大鼠行相应处理，在固定疗程后处死，且处死前均注射BrdU以标记增殖细胞。结果发现针刺组BrdU/Nestin双标细胞数在疗后明显高于疗前，其结果有统计学意义。且针刺组疗后BrdU/Nestin双标细胞数也较其他两组治疗后相比有统计学意义。证明针刺督脉对NSC表达有促进作用。罗丁等[24]观察针刺人中穴对脑缺血大鼠NSC表达的影响，将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、针刺组，同样在处死前注射BrdU，在7 d取材观察大鼠皮质、海马和纹状体BrdU/Nestin阳性细胞数，发现在上述三个区域，针刺组的阳性细胞数与其他组相比均明显升高，结果亦有统计学意义。刁利红[25]等试图通过针刺承浆、气海、关元等任脉穴刺激脑缺血大鼠侧脑室下区神经干细胞表达。发现针刺组新生NSC表达在7、14、28 d三个时间点与空白组和同时间点模型组相比显著升高，说明针刺任脉对NSC表达亦有促进作用。

3 讨论

通过上述实验结果可以看到，针刺的确可以促进脑卒中模型动物脑组织内NSC增殖，修复损伤神经组织，继而改善神经功能缺损症状。目前对神经再生技术的研究虽不断取得突破，人们已能通过更多的方法使NSC扩增，但这些方法在促进NSC增殖的同时也会对实验动物产生一些不良反应，如上述提到的排斥反应、致畸作用，甚至是伦理问题等，使得该技术仍主要停留在实验室阶段。针刺疗法自古就是中医治疗脑病的主要方法，随着现代医学发展，人们也在不断探讨针刺对脑卒中起到治疗作用的可能机制，针刺对干细胞影响的研究就是其中之一。如果说神经再生技术为脑卒中的治疗提供了新的思路，那么针刺疗法则是将神经再生技术引入到临床治疗脑卒中的一座桥梁。目前的实验多是在证明针刺对NSC能起到增殖作用，但对针刺如何能刺激NSC增殖的机制研究仍然不多，人们对其中的原因也众说纷纭。有人认为[26-28]，其可能的机制是针刺可以使脑血管扩张，血流速度加快，从而使更多的氧进入脑组织，为NSC的增殖提供好的内环境；还有人认为，由于NSC的增殖是靠多种调节因子和信号通路的参与共同实现的，所以针刺有可能是通过刺激某些调节因子或者刺激某些与神经细胞增殖有关的通路来间接对NSC的增殖发挥作用。总之，有关针刺促进NSC增殖的机制仍有待深入研究。

[1] 吴江.神经病学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2005:150.

[2] 孟红旗,全亚萍.神经干细胞在神经系统疾病中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1):175-178.

[3] Reynolds BA,Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255:1707-1710.

[4] McKay R.Stem cells in the central nervous system[J].Science,1997,276(5309):66-71.

[5] Evans MJ,Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

[6] Bain G,Kitchens D,Yao M,et al.Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro[J].Dev Biol,1995,168(2):342-357.

[7] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126:663-676.

[8] Orkin SH,Zon LI.Hematopoiesis:an evolving paradigm for stem cell biology[J].Cell,2008,132:631-644.

[9] Alliot F,Rutin J,Leenen PJ,et al.pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N,aminopeptidase A,and nestin[J].J Neurosci Res,1999,58(3):367-378.

[10] About I,Laurent-Maquin D,Lendahl U,et al.Nestin expression in embryonic and adult human teeth under normal and pathological conditions[J].Am J Pathol,2000,157(1):287-295.

[11] 顾恩妍,哈福.神经干细胞的鉴定方法[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(10):1947-1950.

[12] 张俊虎,王建交.神经干细胞的鉴定[J]中国组织工程研究,2012,16(27):5108-5112.

[13] Sugiyama-Nakagiri Y,Akiyama M,Shibata S,et al.Expression of RNA-binding protein Musashi in hair follide development and hair cycle progression[J].Am J Pathol,2006,168(1):80-92.

[14] Ngwenya LB,Rosene DL,Peters A.An ultrastructural characterization of the newly generated cells in the adult monkey dentate gyrus[J].Hippocampus,2008,18(2):210-220.

[15] 郭霞珍.中医基础理论[M].上海:上海科学技术出版社,2006:64-65.

[16] 李丹,邹伟,王珑,等.针刺对实验性脑出血急性期大鼠脑组织Nestin表达的影响[J].中医药学报,2010,38(2):60-62.

[17] 胡科,任应国,徐明超,等.针刺联合康复训练对MCAO大鼠内源性神经干细胞增殖的影响[J].南京中医药大学学报,2016,32(1):50-53.

[18] 吴洪阳,王华,吴绪平.头穴透刺对急性脑缺血大鼠海马齿状回Nestin影响的研究[J].中国康复,2013,28(2):87-89.

[19] 田德禄,蔡淦.中医内科学[M].上海:上海科学技术出版社,2006:404.

[20] 陶静,薛偕华,陈立典,等.不同干预方法对局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖的影响[J].中国康复医学杂志,2010,25(2):99-103.

[21] 高剑峰,吕风华,朱长连,等.电针干预对老龄大鼠脑缺血再灌注海马内源性神经干细胞增殖分化的影响[J].中华中医药杂志,2010,25(7):1076-1079.

[22] 饶晓丹,于海波,皮敏,等.针刺任督脉对脑缺血神经干细胞影响的理论初探[J].中医药学刊,2006,24(4):620-621.

[23] 杨振,李佩芳,王频.刺督调神针法对大鼠脑缺血性损伤神经干细胞增殖、分化的实验研究[J].中医药临床杂志,2013,25(12):1113-1116.

[24] 罗丁,樊小农,赵海英,等.针刺人中穴对MCAO大鼠中枢神经系统神经干细胞增殖影响的研究[J].天津中医药,2014,31(9):548-551.

[25] 刁利红,于海波,皮敏,等.电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠侧脑室下区原位神经干细胞增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(8):1435-1439.

[26] 惠建荣,庞苗,王院春,等.针刺促进脑缺血后内源性神经干细胞增殖分化的研究进展[J].陕西中医,2015,36(5):637-639.

[27] 杨春壮，冯克俭，刘星，等.电针对神经干细胞海马内移植老年性痴呆大鼠行为学及海马超微结构的影响[J].中医药学报，2012，40(4)：87-89.

[28] 王倩，范文涛，贺又舜.地黄饮子含药血清对胎鼠海马神经干细胞迁移的影响[J].中医药学报，2015，43(1)：8-10.

Research Progress about the Effect on the Proliferation of Neural Stem Cellsafter Stroke by Acupuncture

ZHANG Beng1,2，SUN Xiao-wei2，ZOU Wei2*，SUN Meng-juan1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

The references in this article are derived from CNKI and Pubmed Databases by inputting the keywords such as stroke,neural stem cell and acupuncture.By summarizing the articles about the advances in the research of neural stem cell in recent years and the influence on the proliferation of neural stem cells of animals after stroke by acupuncture,we conclude that acupuncture can do promote the proliferation of neural stem cells and repair damaged neural tissues.However, the mechanism is still unclear.

Stroke;Neural stem cell;Acupuncture

国家自然科学基金面上项目(No.81273824)

张菶(1987-)，男，黑龙江中医药大学博士研究生在读，主要研究方向：中西医结合治疗脑血管病临床和机理研究。

邹伟*(1965-)，男，主任医师，博士研究生导师，主要研究方向：中西医结合治疗脑血管病的临床机理研究。

2016-06-21

R246

A

1002-2406(2016)06-0112-04

修回日期：2016-07-01