内毒素在小鼠肝癌发生过程中的作用

韩殿冰　曾本华　葛成果

1)河南汝州市人民医院肝胆外科　汝州　467500； 2)第三军医大学实验动物研究所　重庆　400000；



内毒素在小鼠肝癌发生过程中的作用

韩殿冰1)曾本华2)葛成果3)

1)河南汝州市人民医院肝胆外科汝州467500； 2)第三军医大学实验动物研究所重庆400000；

资料表明，微生物在癌症的发生中起着重要作用，例如幽门螺杆菌是引起胃癌发生的重要因素[1]，人类乳头状瘤病毒是引起宫颈癌的重要因素[2]，特异性的细菌感染是引起结直肠癌的重要因素[3]。但细菌是否也是引起肝癌的重要因素及细菌的代谢产物内毒在肝癌的发生中起到何种作用，均为今后临床需关注的问题。

1材料与方法

1.1主要试剂二乙基亚硝铵(N-Nitrosodiethylamine,DEN)、脂多糖和抗内毒素IgY(Immunoglobulin yolk，IgY；北京百灵威科技有限公司)。内毒素(LPS E.Coli0111:B4；美国Sigma公司)。内毒素测定所用试剂盒(上海伊华临床医学科技公司)。

1.2动物分组和模型建立6周龄BaLB/C无菌雄性小鼠20只，购于第三军医大学实验动物所，普通6周龄BaLB/C雄性小鼠20只，购于郑州大学实验动物中心。无菌小鼠饲育于无菌隔离器中，饲养环境为20 ℃～23 ℃，湿度为40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。饲料和垫料均经过60Co-γ50kGy射线辐照灭菌，饮水、鼠笼和饮水瓶等经过高温高压灭菌后传进无菌隔离器。10只无菌小鼠自由饮用浓度为0.01%的DEN液(A组)，另10只无菌小鼠在饮用同样浓度DEN液的同时，每日腹腔注射一次脂多糖(0.1 mg/kg)(B组)。10只普通小鼠饮用同样浓度的DEN液(C组)，另10只普通小鼠在饮用同样浓度DEN液的同时，每日腹腔注射一次抗内毒素IgY(1.6 mg/kg)(D组)。

1.3血浆内毒素水平测定眼眶采血，分离血浆，按照试剂盒的方法用定量鲎试剂测定法检测血浆内毒素水平。

2结果

2.1肝癌发生率诱癌18周后，停用所有药物24 h，第2天所有小鼠剖腹取肝脏，对怀疑肝癌的部位取肝组织做病理切片，结果肝癌发生率A组为0(0/9)，B组为66.7%(6/9)，C组为77.8%(7/9)，D组为12.5%(1/8)(表1，图1)。取病理前，A、B、C、D四组小鼠分别死亡1、1、1、2只小鼠，死亡时间均发生在诱癌后的3～4周，死亡小鼠取病理未发现肝癌，考虑为DEN液中毒死亡。

2.2肿瘤数量发生肝癌的肝脏，肝癌常是散在多发，数目2～8个不等。其中C组9只小鼠发生肝癌数量最多，共有31个，各组肝癌数量见表1。

2.3肿瘤大小肝癌一般较小，多为米粒大小，直径2.6～16 mm，各组肝癌平均直径见表1。

2.4肝/体比肝脏重量与小鼠自体重量的比值，C组最高为11.3%，A组最低为5.2%，各组肝/体比见表1。

表1　血清内毒素水平和肝癌发生情况

注：*与C组比较，P<0.01；#与B组比较，P<0.01；$与C组比较，P>0.05；Δ与D组比较，P<0.01。

2.5血清内毒素水平肝癌发生率较高的B组和C组内毒素水平最高，肝癌发生率较低的A组和D组内毒素水平最低。

2.6血清内毒素与肝癌发生情况的相关性各组的内毒素水平与肿瘤数量、平均肿瘤直径呈显著正相关(r=0.875、0.812，P均<0.01)。

1A:A组肝脏有散在的细小结节，但没有发现肝癌

1B:B组肝脏细小结节数量较多，多数动物出现肝癌，常有多个肝癌病灶并存于一个肝脏

1C:C组肝癌的发生率最高，常有多个肝癌病灶并存于一个肝脏

1D:D组肝癌发生率较低，该肝脏有两个肝癌病灶。

图1诱癌18周后各组肝脏的情况

3讨论

资料表明[4]，诱发性肝癌动物模型中，以诱癌剂二乙基亚硝胺(DEN)的诱癌成功率较高，对肝脏致癌有较好的专一性，且大部分癌变为肝细胞癌，是目前应用较广泛的一种诱发性肝癌模型。

在致癌物的作用下肠道菌群的变化能诱发肝癌[5]，肠道有菌小鼠有很高的肝癌发生率，而肠道无菌小鼠极少出现肝癌[6]。我们的实验表明，无菌小鼠(不仅仅肠道无菌)口服致癌物DEN后，未出现一例肝癌，而普通小鼠有很高的肝癌发生率，结合上面的资料，可以认为，细菌在肝癌的发生过程中起重要作用。该实验表明。实验之初也曾想过，由于无菌动物的免疫力低下，理论上讲，无菌小鼠应该更容易成癌，现在看来免疫力的高低不是引起肝癌的根本原因。

细菌在肝癌的发生过程中起重要作用，细菌的代谢产物内毒素(一种脂多糖)在其中起何种作用。为此我们给无菌小鼠腹腔注射内毒素，同样喂食致癌物DEN液。18周后发现，无菌小鼠也诱导出肝癌，肝癌发生率与普通有菌小鼠的肝癌发生率相近，而且肿瘤数量、平均肿瘤直径和肝/体比等均无明显差异。抗内毒素IgY作为LPS的特异性多克隆抗体，可有效拮抗LPS的生物学效应[7]。本实验中，对有菌小鼠腹腔注射抗内毒素IgY同样喂食DEN液后，只有一只小鼠产生肝癌。内毒素水平的检测也同样表明，在内毒素水平最高的B组和C组，肝癌发生率最高。而内毒素水平最低A组和D组，肝癌发生率最低。统计学的相关性分析表明，各组内毒素水平与肿瘤数量、平均肿瘤直径呈显著正相关。上述结果均表明，表面层次上看细菌是引起肝癌的重要因素，但不能排除细菌代谢产物内毒素为引起肝癌的根本原因之可能。

部分文献报道，[8]致癌物DEN在肝脏的代谢过程中引起DNA损伤，导致肝癌发生。但本次观察发现，DEN在诱发肝癌的过程中必须有内毒素的参与，没有内毒素的参与，单独DEN难以诱发肝癌，因此不排除内毒素在DEN 诱发肝癌的过程中起到重要作用，但其作用机理尚不清楚。

该实验还发现在DEN诱发肝癌的过程中，无论是否产生肝癌，无菌动物肝脏的硬化程度较重而有菌动物的硬化程度较轻(图1)，发生此现象原因尚不清楚，有待进一步研究。

总之，本研究表明，没有细菌，就不会发生肝癌，而不排除细菌代谢产物内毒素是引起肝癌的根本原因，可做为进一步揭开肝癌的发病机理等研究方法的新途径之一。

参考文献4

[1]郭云霞,王郁杰,朱莹.幽门螺杆菌感染与胃癌的相关性探讨[J].中华医院感染学杂志.2014,24(7): 1 700-1 701.

[2]吴兵,张崇移,李铭芬. 人乳头状瘤病毒感染与宫颈病变的相关性研究[J].中华医院感染学杂志.2013,23(10): 2 377-2 379.

[3]解玲玲,朱元民,刘玉兰.特异性细菌感染与结直肠癌发病的关系[J].中华消化杂志. 2014,34(5): 359-360.

[4]Yoshiji H,Yoshii J,Ikenaka Y,et al.inhibition of reninangiontensin system attenuates liver enzyme-alreed preneoplastic lesions and fibrosis development in rats[J].J Hepatol,2002,37(1):22-30.

[5]Shin Yoshimoto,Tze mun Loo,Hiroaki Kanda,et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome[J].Natrure,2013, 499：97-102.

[6]Dianne H.Dapito,Ali Mencin,Geum-Youn Gwak.er al.Promotion of hepatocellular carcinoma by th intestinal microbiota and TLR4[J]. Cancer Cell. 2012, 21(4):504-516.

[7]李强，张雅萍.抗内毒索IgY 体外拮抗内素效应的实验研究[J]．第三军医大学学报，2004，26(7)：610.

[8]Knasmuller S,Steinkellner H,Hirschl AM,et al.Impact of bacteria in dairy products and of the intestinal microflora on the genotoxic and carcinogenic effects of heterocyclic aromatic amines[J].Mutat Res,2001,480:129-138.

(收稿2015-06-21)

·论著·

3)重庆医科大学第二附属医院泌尿外科重庆400000

【摘要】目的探讨内毒素在二乙基亚硝铵(DEN)诱发小鼠肝癌过程中的作用。方法 四组雄性小鼠均喂食致癌物DEN液，A组为无菌小鼠，B组无菌小鼠腹腔注射内毒素，C组为普通小鼠，D组普通小鼠腹腔注射抗内毒素IgY。观察肝癌发生率和血清内毒素水平。结果内毒素水平最高的B组和C组肝癌发生率最高，内毒素水平最低的A组和D组肝癌发生率也最低，内毒素水平和肝癌发生率呈显著正相关。结论细菌的代谢产物内毒素是引起肝癌的根本原因。

【关键词】内毒素; 细菌;二乙基亚硝铵; 肝癌

Role of endotoxin in pathogenesis of hepatocellular carcinoma in miceHanDianbing,ZengBenhua,GeChengguo.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeople’sHospitalofRuzhouCity,RuhouHenan467500,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of endotoxin in HCC induced by the DEN.MethodsFour groups of male mice were fed with DEN. Group A is the germ free mice, group B is also the germ free mice injected by endotoxin in abdominal cavity. group C is normal bacterial mice, group D is also normal bacterial mice injected by anti-endotoxin IgY in abdominal cavity.ResultsThe highest level of endotoxin in B group and C group had the highest incidence of hepatocellular carcinoma, the lowest level of endotoxin in A group and D group, the incidence of HCC is lowest. Endotoxin levels and the incidence of HCC was positively related.ConclusionEndotoxin is the root cause of liver cancer.

【Key words】Endotoxin;Bacteria;DEN;HCC

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1077-8991(2015)06-0001-03