内质网应激在2型糖尿病发病机制中的研究进展

刘向荣,朴春丽,米　佳,刘扬扬,王　璞

(1.长春中医药大学，吉林 长春130117;2.长春烧伤医院;3.吉林大学临床医学院2013届)



内质网应激在2型糖尿病发病机制中的研究进展

刘向荣1,2,朴春丽1*,米佳1,刘扬扬1,王璞3

(1.长春中医药大学，吉林 长春130117;2.长春烧伤医院;3.吉林大学临床医学院2013届)

糖尿病是由环境因素和遗传因素共同作用而引起的一组以糖代谢紊乱、体液失衡为主要表现的临床综合征，有着极高的致残率和死亡率[1-3]。糖尿病的患病人数正逐年增加，目前全世界约有糖尿病病人2亿，预计十年后患病人数将增加1亿，而新增加的患病人口约2/3-3/4集中在发展中国家。在糖尿病的患病人群中，2型糖尿病发病尤为广泛，约占患病人数的90%，给人类健康造成了极大的危害，并且带来了严重的经济负担。深入阐述及研究其疾病发生机制意义重大[4-6]。我们一般认为：2型糖尿病的发生是以胰岛素的抵抗和胰岛Β细胞功能障碍为特征的。脂毒性，高血糖和炎症反应与这一疾病密切相关[7]。1995年Unger[8]等研究发现组织的慢性炎症反应是导致糖尿病发病的关键环节。血糖和脂质升高，尤其是饱和脂肪酸的升高，是胰岛素抵抗的特征性改变。在此基础上2002年[9]Harding提出了2型糖尿病通过内质网应激而发病，到2004年 science发表文章显示内质网应激(endoplasmic recticulum stress)是导致糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖发生的重要环节，由此ERS成为治疗糖尿病的一个新的并具有强大潜力的新靶点[10]。

1内质网和未折叠蛋白

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是哺乳动物最重要的细胞器，是蛋白质合成，折叠和转运的重要场所，参与脂质合成和维持钙离子的储存。它的主要功能是确保蛋白质具有正常生理结构和功能。当未折叠或错误折叠的蛋白质数量增加时，这些畸变蛋白就会被细胞浆内的内质网相关降解酶所降解，然而,当未折叠或者错误折叠的蛋白质的数量超过内质网所能承受的能力，内质网自身的负担加重，内质网稳态被打破，产生一系列氧化应激反应。我们把这种内质网稳态的改变称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，即各种原因导致的未折叠或错误折叠蛋白质在内质网的堆积[11]。Han Liu[12]等报道很多原因可以导致内质网应激的发生，如代谢性因素(高血脂，高血糖)，钙离子的失衡，炎症反应，氧化应激等，内质网的稳态一旦被打破，细胞凋亡随即发生。内质网应激初早期，细胞的内质网通过扩张体积，提高蛋白质折叠能力，调节蛋白质转录和翻译，清除未折叠蛋白质和错误折叠蛋白质等方式降低蛋白质的合成，这一系列复杂的通路反应即未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)。UPR的最终目的是减轻内质网应激与重建内质网稳态。越来越多的研究表明，如果内质网应激时间延长或超过自身处理能力时，内质网会启动程序性细胞凋亡过程[13]。

内质网应激的发生主要依赖于内质网膜上的3种跨膜蛋白，它们分别是肌醇依赖酶IRE1(inositol-requiring kinase-1)、存在α和Β两种亚型，RNA依赖的蛋白激酶样激酶PERK(PER-related endoplasmic reticulum eukaryotic initiation factor 2αkinase)、活化转录因子ATF6(activating transcription factor 6)，内质网通过这3种蛋白感受未折叠或错误折叠蛋白质信号并将此信号传递到细胞基质。生理状态下，这3种蛋白与内质网分子伴侣Bip(immunoglobulin binding protein)/Grp78(78-kDa glucose-regulated protein)稳定结合。当内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白质发生堆积或钙离子平衡发生紊乱时，Bip解离出来，作为分子伴侣与未折叠蛋白或者错误结合蛋白结合，最终一个由IRE-1，ATF6和PERK参与的信号转导系统被激活[14]。

2UPR信号转导机制

IRE-1是一种跨膜蛋白，它具有内在激酶活性和核糖核酸酶活性，对未折叠和错误折叠的蛋白质敏感，生理情况下，IRE-1α与Bip结合，然而应激发生时，IRE-1α与Bip/Grp78分离，在Ser724点位上发生磷酸化及寡聚化反应[15]，从而激活IRE-1αRNA的活性，使其中的26个核苷酸从X盒结合蛋白1( X-box binding protein 1，XBP1)的 mRNA中解离出来，最终这种未剪切的mRNA(即XBP1u)转变成XBP1片段，即XBP1s[16]， XBP1s经过翻译后作为转录因子进入细胞核，XBP1s的作用就是提高UPR基因、脂肪生成基因、脂质代谢和炎症基因的转录[17]。除此之外，在调节IRE-1依赖的核衰减mRNA(它可以分裂包括脂质代谢基因的底物)的过程中，通过IRE-1核糖核酸内切酶活性，IRE-1可以产生适应性的信号或者死亡信号，从而诱导IRE-1依赖的mRNA的凋亡(regulated IRE-1 dependent decay of mRNA RIDD)[18]。 Ghosh等[19]研究发现IRE1α的RNA酶的变构抑制可以保护在内质网应激过程中胰岛β细胞的活力与功能。β细胞XBP1基因突变小鼠可表现出高血糖与葡萄糖耐量异常表明IRE1α-XBP1信号通路对于β细胞至关重要[20]。

ATF6的细胞质域和内质网域对蛋白折叠的状态极为敏感，当感受到未折叠或错误折叠蛋白质信号后，N端就会被剪切，与Βip解离，转移至高尔基体，经过1型蛋白酶(site-1 protease)S1P和2型蛋白酶(site-2 protease)S2P水解加工后，细胞质的部分被释放出来并且作为转录因子调控以XBP1为主的相关降解因子表达，蛋白的折叠/成熟和分泌[21]，它们是具有活性的转录因子，可以诱导CHOP基因的表达， CHOP的过度累积可诱导细胞发生凋亡。

当发生内质网应激时，PERK与GRP78解离，发生自身二聚化和磷酸化，催化下游真核起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，eIF2)的磷酸化，引起活化转录因子4(activating transcription factor4，ATF4) 的高表达，ATF4可以上调氨基酸代谢以及增强子CCAAT结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP) 的转录和DNA损伤诱导的基因34(GADD34)的表达[22]。PERK同时磷酸化和激活Nrf2(nuclear factor erythroid related factor 2)的表达。ATF6和PERK都是通过增加CHOP的基因表达而诱导细胞凋亡的。研究表明PERK在胰.岛中存在高表达[23]，当与Bip发生解离后，PERK通过而激活。活化的PERK通过使下游eIF2α磷酸化下调蛋白质合成过程，但是可以提高ATF4 mRNA的翻译水平[24]。IRE1α-XBP1与PERK-eIF2α信号通路共同作用调节胰岛素的分泌，再次说明UPR在胰岛β细胞中发挥重要作用。ATF6和PERK通路都是通过CHOP的转录诱导细胞凋亡的。

以上3条是处理未折叠蛋白经典的信号通路，通过这3条通路的协同作用，对堆积未折叠或错误蛋白质进行处理，从而维持细胞稳态，若损伤严重，稳态不能及时恢复，则会启动细胞凋亡程序。

另有研究表明，除了Bip，IRE-1β本身也是UPR(Unfolded protein response)感受器，它不通过Bip，而直接干预未折叠蛋白的级联反应；当发生内质网应激时，糖基化的ATF6就会极大的妥协；而硫氧还原蛋白(TXNIP thioredoxin-interacting protein )则会通过二硫化物异构酶(PDI protein disulfide isomerase)调节内质网应激[25]。

3胰腺β细胞与内质网应激

胰腺β细胞是体内唯一有胰岛素分泌功能的细胞，具有高度发达的内质网，在β细胞中PERK、IRE1α和Bip均高表达，因此，β细胞成为对内质网应激最敏感的组织细胞之一。生理状态下，胰岛β细胞不断地分泌胰岛素，其内含有大量成熟的高尔基体，胰岛素的前体在内质网腔内定位、剪切掉其标志序列，从而形成胰岛素原，β细胞内质网能高度敏感地控制胰岛素原的折叠，胰岛素原完成氧化折叠、成熟变构并转运至高尔基体，最终以分泌颗粒的形式出胞发挥功能[26]。在病理状态下，当进入内质网腔内的胰岛素量超过内质网折叠能力、或者内质网的钙耗竭时，内质网应激就发生了。内质网应激与胰岛素抵抗、炎症反应、脂质堆积、胰岛素生物合成、β细胞的凋亡密切相关，研究内质网稳态改变的机制将会为2型糖尿病的预防和治疗提供新的药理学靶点。在2型糖尿病的发展过程中，胰岛素抵抗可以由胰岛β细胞分泌增加补充，然而，体内的胰岛素需求量最终会超越β细胞的分泌能力，由此就不可避免的加重内质网的负担，内质网中未折叠蛋白的增加最终启动细胞凋亡[27,28]。

内质网应激参与的胰岛β细胞凋亡的信号通路，较经典的主要包括：c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路--未折叠或者是错误折叠蛋白的过度累积诱发内质网应激，活化IRE1α，与肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)及凋亡信号调节激酶(ASK1)结合,而通过IRE-1激活，Yamaguchi[29]等证明ASK1本身可以通过ASK-p38路径促进细胞凋亡，同时IRE-TRAF2-ASK1复合体，通过激活JNK，进而激活线粒体依赖的细胞凋亡[30]。JNK被激活后可促进胰岛素受体底物丝氨酸的磷酸化，阻碍胰岛素的信号转导，最终促使炎症细胞的表达，引起内质网的应激，导致胰岛素抵抗[50]。当发生ERS时，JNK活化，JNK导致胰岛素受体底物1发生丝氨酸磷酸化，IRS1的丝氨酸磷酸化使IRS1的酪氨酸磷酸化受到抑制，同时激活PI3K，使胰岛素受体的信号转导受抑制，细胞对胰岛素的敏感性下降，导致IR[51]；CHOP( C/EBP homologous protein-10)信号通路--CHOP属于C/EBP转录因子家族成员，是内质网应激特异的转录因子，正常情况下表达水平很低，内质网应激发生时表达水平升高。研究发现，内质网应激可以介导游离脂肪酸(FFA)诱导的细胞凋亡，且随着β细胞凋亡增加，CHOP基因表达增加[31];caspase 凋亡通路 内质网应激情况下 ,由于Ca2+平衡紊乱而激活的钙蛋白激酶可以直接剪切并激活 caspase -12[32]。近年来，随着研究的深入，Mig6信号通路-mig6被确定为负反馈表皮生长因子调节信号，通过与表皮生长因子受体(epidemal growth factor receptor EGFR)结合，Mig6控制表皮生长因子受体信号通路的时间和空间连续性[33]，Yi-ChunChen[34]等证实Mig6可以通过诱导Caspase3的表达促进B细胞凋亡，持续大量的Mig6表达还会加重内质网应激。

4脂肪细胞与内质网应激

肥胖导致脂肪组织中慢性内质网应激的发生。事实上，肥胖患者脂肪组织的肌醇需要酶IRE-1a和c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及X盒结合蛋白1(XBP1s)表达均上调[35]。Gregor[36]等证实，因为胃部手术体重减轻的肥胖患者XBP1S和BIP及eIF2a和JNK的表达下调。而运动训练减少内质网应激和胰岛素抵抗在肥胖鼠白色脂肪组织中的发生[37]。饱和脂肪酸通过PERK依赖机制增加肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素IL-6的表达[38]。这些因子的表达增加可以诱导内质网应激的负反馈调节，同时活化的PERK也可以调节脂肪组织的胰岛素反应[39]。除了饱和脂肪酸，暴露于脂多糖或葡萄糖的人体脂肪细胞增加激活转录因子ATF-6和IRE-1a依赖的伴侣表达[40]，激活的IRE-1a可以活化JNK，这反过来可以磷酸化丝氨酸残基上的胰岛素受体底物，从而促进胰岛素抵抗的发生[41]。

内质网应激的发生有诸多诱发因素：脂毒性，糖毒性，炎症，胰岛素原和淀粉样蛋白的积累。其中脂毒性是胰腺β细胞发生内质网应激的重要诱因，饱和脂肪酸(例如，棕榈酸)激活UPR的PERK、IRE-1通路，从而分别诱导eIF2α的磷酸化和XBP的拼接；反之，不饱和脂肪酸(如油酸)则显示出保护作用。错误折叠的胰岛素原和人胰岛淀粉样多肽hIAPP(human islet amyloid polypeptide)的积累也引起内质网应激，因此，参与细胞功能障碍和细胞凋亡[42]。来自于IL-23,24,33的炎症细胞通过活化ATATS(signal transducers and activators of transcription)和NF-kB( nuclear factor-kB)诱导内质网应激的发生[43]。相比之下，IL-22，抑制活性氧和亚硝酸盐的累积，防止细胞因子诱导的内质网应激或糖脂毒性，即IL-22下调促氧化基因的表达，同时上调抗氧化基因的表达[44]。高血糖引起内质网应激传感器TXNIP表达，它是另一个相关的促凋亡β细胞因子。同样地，ASK1(apoptosis signal regulating kinase)，被IRE-1激活后，促进β细胞的破坏和凋亡。饱和脂肪酸通常具有细胞毒性，而不饱和脂肪酸一直内质网应激的发生从而减少细胞凋亡[45]。

胰岛素的合成开始于内质网，胰岛素原须在此正确折叠，有效运输至高尔基体，经过进一步的加工过程，形成成熟的胰岛素发挥作用。错误折叠的蛋白质(例如，胰岛素原)在内质网中蓄积通过PERK介导的eIF2磷酸化和转录诱导ATF4和凋亡基因CHOP的表达导致β细胞死亡[46]。由于胰岛素原合成的不断增加，错误折叠的胰岛素原在胰腺β细胞内质网中积累，从而导致UPR通路的激活[47]。在90%的2型糖尿病患者中，错误折叠的人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)不断累积，形成胰岛淀粉样蛋白，激活UPR是参与β细胞功能障碍。值得注意的是，ER伴侣衰减使细胞表达hIAPP增加，从而进一步加重内质网应激[48]

胰岛素抵抗是2型糖尿病发病危险因素之一，在疾病的临床前期，胰岛的β细胞通过提高β细胞的数量和胰岛素的分泌量来对抗胰岛素抵抗，当这种平衡被打破，胰岛素的相对不足就会随之出现，2型糖尿病随之发生[49]。最近的研究结果表明，内质网中错误折叠的蛋白及随后激活未折叠蛋白应答信号在IR和T2DM发病机制中发挥重要作用，靶向蛋白质折叠和UPR信号转导可能是一个可行的用于治疗2型糖尿病的治疗方法。此外，一些对药物代谢存在有利影响的治疗2型糖尿病的临床用药，其作用机理可能来源于这些药物调节内质网应激和未折叠蛋白应答信号的能力。然而，仍需要更多的研究来阐述内质网应激，因为矛盾的是，参与UPR的一些关键蛋白的激活可能对T2DM的治疗有益。因此，仍需不断探索及阐明内质网应激与胰岛Β细胞功能损伤及凋亡的确切机制。

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基金项目：国家自然科学基金项目(项目编号：81273686)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)07-1193-05

(收稿日期：2016-03-25)