红花细胞培养物化学成分研究

谭圳，陈日道，解可波，杨林，戴均贵

·论著·

红花细胞培养物化学成分研究

谭圳，陈日道，解可波，杨林，戴均贵

目的研究红花细胞培养物的化学成分。

方法采用固体 MS 培养基，对红花细胞进行放大培养，通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20 凝胶柱色谱、半制备HPLC 等方法对红花细胞培养物的化学成分进行分离纯化，质谱和核磁共振等波谱方法进行化学成分的结构鉴定。

结果从红花细胞培养物中分离并鉴定了 12 个化合物，分别是豆甾-5-烯-3β，7β-二醇、豆甾-5-烯-3β，7α-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7β-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7α-二醇、十六烷酸甘油酯、丁香酸甲酯、3，5-二甲氧基-对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、N-阿魏酸酰-对羟基苯乙胺、芥子酸乙酯、丁香脂素。

结论化合物豆甾-5-烯-3β，7β-二醇、豆甾-5-烯-3β，7α-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7β-二醇、豆甾-5，22-二烯-3β，7α-二醇、丁香酸甲酯、3，5-二甲氧基-对羟基苯甲醛、N-阿魏酸酰-对羟基苯乙胺、芥子酸乙酯均为首次从红花植物中分离得到。

红花；细胞培养技术；化学成分

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术， 2016， 11（4）：319-323

菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）是常用中药，始载于《开宝本草》，其花入药，具有活血祛瘀、通经止痛等功效［1］。现代药理实验证明红花的化学成分具有抗乳腺癌、抗肝癌、抗焦虑和抗抑郁、抗糖尿病、抗心肌缺血和舒张血管、镇痛和抗炎等药理活性［2-8］。尽管红花作为一种名贵药用植物已大量栽培，但需要大量的土地，且球腐病、叶斑病、根腐病等病害影响着红花的生产与质量。为了减少对土地资源的依赖以及病虫害，获得质量稳定的红花产物，采用植物组织细胞培养技术进行红花药用化学成分的生物合成甚至大规模生产是切实可行的途径。虽然已有红花组织培养和快速繁殖等方面的研究报道［9-11］，但目前对红花细胞培养物中化学成分的系统研究较少。本研究组建立了红花细胞培养体系，并进一步对其化学成分进行较为系统的研究。利用多种色谱方法从红花细胞培养物中分离得到 12 个化合物，通过质谱和核磁共振波谱等方法对其结构进行了鉴定，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1植物细胞红花由本实验室诱导，继代培养，并保藏于本实验室。

1.1.2仪器VNMR SYSTEM-400 型核磁共振波谱仪为美国 Varian 公司产品；AVIIIHD 500 MHz 和 AVIIIHD 600 MHz 核磁共振波谱仪为美国Bruker 公司产品；1200 分析型高效液相系统为美国 Agilent 公司产品；Q-TOFLC/MS 质谱仪为美国Thermo 公司产品；LC-20AT 半制备高效液相仪为日本岛津公司产品；YRU-883A RI 检测器为日本Shiseido 公司产品；反相半制备色谱柱 GRACE C18（10 mm × 250 mm，5 μm）为美国 Alltech Associates 公司产品；正相半制备色谱柱 YMC Silica（10 mm × 250 mm，5 μm）为日本 YMC 公司产品。

1.1.3试剂分析纯乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、石油醚、氯仿为北京化工厂生产；色谱级甲醇为美国 Sigma 公司生产；Sephadex LH-20由瑞典 Amersham Bioscience 公司生产；柱色谱硅胶（200 ～ 300 目和 60 ～ 100 目）和 GF254硅胶板均为青岛海洋化工厂产品。

1.1.4细胞培养基MS 培养基：NH4NO31.65 g/L、KNO31.90 g/L、KH2PO40.17 g/L、MgSO4·7H2O 0.37 g/L、CaCl2·H2O 0.44 g/L、KI 0.83 mg/L、H3BO36.20 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、MnSO4·4H2O 22.30 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.60 mg/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L、EDTA-Na237.30 mg/L、肌醇 100 mg/L、VB60.50 mg/L、VB10.10 mg/L、甘氨酸 2 mg/L、烟酸 0.50 mg/L、蔗糖 40 g/L，并调 pH 5.8。

1.2方法

1.2.1细胞培养红花愈伤组织为选用种子萌发后的无菌苗叶片经 MS 培养基、0.5 mg/L α-萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）和 0.2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）诱导产生。产生的愈伤组织在固体 MS 培养基附加 1.0 mg/L 2，4-D、1.0 mg/L NAA 及 1.0 mg/L 6-BA 黑暗静置培养 30 d 后，收集细胞培养物，于60 ℃ 下烘干。

1.2.2提取分离红花干燥细胞培养物 380.0 g 用 75% 乙醇回流提取 3 次，每次 6 h，合并提取液并减压浓缩成浸膏（80.0 g）。浸膏用热水 1.5 L分散，依次用石油醚 2.0 L、乙酸乙酯 2.0 L、正丁醇 2.0 L 萃取 3 次，得到石油醚部分 7.3 g，乙酸乙酯部分 9.8 g，正丁醇部分 25.4 g。

石油醚部分经硅胶柱色谱（200 ～ 300 目）分离，依次用石油醚-丙酮（1∶0、20∶1、8∶1、4∶1、1∶1、0∶1）系统梯度洗脱得到 9 个流分（Fr.1 ～Fr.9）。流分 Fr.6（495.6 mg）经正相半制备 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 7∶3，v/v，流速 4.0 ml/min）后再经反相半制备 HPLC（甲醇∶水 = 92∶8，v/v，流速 3.0 ml/min）纯化得到化合物 1（1.4 mg，tR= 46.5 min）和化合物 3（1.5 mg，tR= 41.0 min）。流分 Fr.7（303.6 mg）经正相半制备 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 8∶2，v/v，流速 4.0 ml/min）、反相半制备 HPLC（甲醇∶水 = 94∶6，v/v，流速 3.0 ml/min）纯化得到化合物 2（0.6 mg，tR= 27.5 min）、化合物 4（1.0 mg，tR= 24.4 min），流分 Fr.7（303.6 mg）经正相半制备 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 8∶2，v/v，流速 4.0 ml/min）后再经反相半制备 HPLC（甲醇∶水 = 85∶15，v/v，流速 3.0 ml/min）纯化得到化合物 5（1.5 mg，tR= 31.5 min）。

乙酸乙酯部分通过硅胶柱色谱（200 ～ 300 目）分离，依次以石油醚-丙酮（9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7、0∶1）系统梯度洗脱得到 18 个流分（Fr.1 ～Fr.18），流分 Fr.2（195.6 mg）经过正相半制备 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 8∶2，v/v，流速 4.0 ml/min）、反相半制备 HPLC（甲醇∶水 = 25∶75，v/v，流速3.0 ml/min）纯化得到化合物 7（3.0 mg，tR= 45.3 min）和 8（1.2 mg，tR= 24.6 min）；经反相半制备 HPLC（甲醇∶水 = 50∶50，v/v，流速 3.0 ml/min，甲醇∶水 = 40∶60，v/v，流速 3.0 ml/min）纯化得到化合物 6（1.0 mg，tR= 28.5 min），11（0.9 mg，tR= 36.2 min）。流分 Fr.5（852.7 mg）经过凝胶柱层析（甲醇∶氯仿 = 1∶1，v/v）、正相半制备HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 7∶3，v/v，流速 4.0 ml/min，正己烷∶乙酸乙酯 = 5∶5，v/v，流速 4.0 ml/min）纯化得到化合物 9（9.4 mg，tR= 5.9 min）。流分 Fr.7 （1.4 g）经过硅胶柱色谱（200 ～ 300 目）分离，依次以石油醚-丙酮（7∶3、6∶4、4∶6、0∶1）系统梯度洗脱得到 8 个流分（Fr.7-1 ～ Fr.7-8），流分 Fr.7-2 （550.0 mg）经过正相半制备 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 55∶45，v/v，流速 4.0 ml/min）、反相半制备 HPLC（甲醇∶水 = 45∶55，v/v，流速 3.0 ml/min）和正相半制备 HPLC（正己烷∶乙酸乙酯 = 47∶53，v/v，流速 4.0 ml/min）HPLC 纯化得到化合物 10 （31.0 mg，tR= 27.8 min）；经反相半制备 HPLC（乙腈∶水 = 36∶64，v/v，流速 3.0 ml/min）纯化得到化合物 12（51.1 mg，tR= 23.3 min）。

2　结果

化合物 1 为无色胶状物，ESI-MS m/z 430.96 ［M + H］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶5.29（1H，s，H-6），3.85（1H，d，J = 8.0 Hz，H-7），3.55（1H，m，H-3），1.05（3H，s，H-19），0.93（3H，d，J = 6.4 Hz，H-21），0.85（3H，t，J = 7.6 Hz，H-29），0.83（3H，d，J = 7.2 Hz，H-26），0.82（3H，d，J = 7.2 Hz，H-27），0.70（3H，s，H-18）。13C-NMR （CDCl3，125 MHz）δ∶143.5（C-5），125.5（C-6），73.4（C-7），71.5（C-3），56.2（C-17），55.3（C-14），48.3（C-9），45.8（C-24），42.9（C-13），41.7（C-4），40.9（C-8），39.5（C-12），36.9（C-1），36.4（C-10），36.0（C-20），34.0（C-22），31.6（C-2），29.2（C-25），28.4（C-16），26.4（C-15），26.3（C-23），23.0（C-28），21.1（C-11），19.7（C-26），19.1（C-19），18.9（C-27），18.8（C-21），12.0（C-29），11.8（C-18）。以上数据与文献［12］中一致，故鉴定为豆甾-5-烯-3β，7β-二醇。

化合物 2 为无色胶状物，ESI-MS m/z 430.91 ［M + H］+；1H-NMR （CDCl3，400 MHz）δ∶5.61（1H，d，J = 3.6 Hz，H-6），3.85（1H，br s，H-7），3.59 （1H，m，H-3），1.10（3H，s，H-19），0.93（3H，d，J = 6.8 Hz，H-21），0.84（3H，t，J = 8.4 Hz，H-29），0.83（3H，d，J = 6.8 Hz，H-26），0.81（3H，d，J = 6.8 Hz，H-27），0.69（3H，s，H-18）。13C-NMR （CDCl3，125 MHz）δ∶146.3（C-5），123.9（C-6），71.4（C-3），65.4（C-7），55.7（C-17），49.4（C-14），45.8（C-24），42.3（C-9），42.2（C-13），42.0（C-4），39.2（C-12），37.5（C-8），37.4（C-10），37.0（C-1），36.1（C-20），33.9（C-22），31.4（C-2），29.1（C-25），28.3（C-16），26.0（C-23），25.9（C-15），23.0（C-28），20.7（C-11），19.8（C-26），19.0（C-27），18.8（C-21），18.3（C-19），12.0（C-29），11.7（C-18）。以上数据与文献［12］中一致，故鉴定为豆甾-5-烯-3β，7α-二醇。

化合物 3 为白色粉末，ESI-MS m/z 411.33 ［M + H - H2O］+，1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶5.29 （1H，s，H-6），5.16（1H，dd，J = 8.8，15.2 Hz，H-22），5.03（1H，dd，J = 8.8，15.2 Hz，H-23），3.85（1H，d，J = 7.6 Hz，H-7），3.55（1H，m，H-3），1.05（3H，s，H-19），1.03（3H，d，J = 6.4 Hz，H-21），0.85（3H，t，J = 6.0 Hz，H-29），0.80 （6H，d，J = 6.4 Hz，H-26，27），0.71（3H，s，H-18）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ∶143.4（C-5），138.1（C-22），129.5（C-23），125.4（C-6），73.3 （C-7），71.4（C-3），56.0（C-17），55.3（C-14），51.2（C-24），48.2（C-9），42.9（C-13），41.7（C-4），40.8（C-8），40.3（C-20），39.5（C-12），36.9（C-1），36.4（C-10），31.8（C-25），31.5（C-2），29.2（C-16），26.4（C-15），25.4（C-28），21.3（C-11），21.3（C-21），21.1（C-27），19.0（C-19），18.8（C-26），12.3（C-29），12.0（C-18）。以上数据与文献［13］中一致，故鉴定为豆甾-5，22-二烯-3β，7β-二醇。

化合物 4 为白色固体，ESI-MS m/z 411.32 ［M + H - H2O］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶5.60 （1H，d，J = 3.2 Hz，H-6），5.17（1H，dd，J = 8.6，15.2 Hz，H-22），5.02（1H，dd，J = 8.5，15.2 Hz，H-23），3.85（1H，s，H-7），3.59（1H，m，H-3），1.03（3H，d，J = 6.4 Hz，H-21），1.00（3H，s，H-19），0.85（3H，t，J = 6.4 Hz，H-29），0.80（6H，d，J = 6.8 Hz，H-26，27），0.71（3H，s，H-18）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：146.2（C-5），138.2 （C-22），129.3（C-23），123.8（C-6），71.3（C-3），65.3（C-7），55.7（C-17），51.2（C-24），49.4（C-14），42.3（C-9），42.2（C-13），42.0（C-4），40.4（C-20），39.1（C-12），37.5（C-8），37.4（C-10），37.0（C-1），31.9（C-25），31.3（C-2），28.9（C-16），25.4（C-28），24.3（C-15），21.2（C-21），21.1（C-27），20.7（C-11），19.0（C-26），18.2（C-19），12.3（C-29），11.8（C-18）。以上数据与文献［14］中一致，故鉴定为豆甾-5，22-二烯-3β，7α-二醇。

化合物 5 为白色固体，ESI-MS m/z 331.17 ［M + H］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶4.22（1H，dd，J = 4.4，12.0 Hz，H-3a），4.14（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-3b），3.93（1H，m，H-2），3.70（1H，dd，J = 3.4，11.6 Hz，H-1a），3.60（1H，dd，J = 6.0，11.6 Hz，H-1b），2.34（2H，t，J = 7.5 Hz，H-5），1.10 ～ 1.70（26H，br s），0.88（3H，t，J = 6.1 Hz，H-19）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ∶174.4（C-4），70.2（C-2），65.1（C-3），63.3（C-1），34.1（C-5），22.7 ～ 31.9（C-6 ～ 18），14.1（C-19）。以上数据与文献［15］中一致，故鉴定为十六烷酸甘油酯。

化合物 6 为淡黄色固体，ESI-MS m/z 213.09 ［M + H］+；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶7.30 （2H，s，H-2，6），3.88（6H，s，-OCH3× 2），3.84 （3H，s，-COOCH3）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ∶166.9（1-CO），146.7（C-3，5），139.2（C-4），121.2（C-1），106.7（C-2，6），56.5（3，5-OCH3），52.2（COOCH3）。以上数据与文献［16］中一致，故鉴定为丁香酸甲酯。

化合物 7 为淡黄色固体，ESI-MS m/z 180.98 ［M + H］-；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶9.81 （1H，s，-CHO），7.23（2H，s，H-2，6），3.92 （6H，s，-OCH3× 2）。13C-NMR（acetone-d6，125 MHz）δ∶191.2（1-CHO），149.1（C-3，5），143.0 （C-4），129.2（C-1），107.8（C-2，6），56.7（3，5-OCH3）。以上数据与文献［17］中一致，故鉴定为3，5-二甲氧基-对羟基苯甲醛。

化合物 8 为淡黄色固体，ESI-MS m/z 120.98 ［M + H］-；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶9.85 （1H，s，-CHO），7.80（2H，d，J = 8.0 Hz，H-2，6），7.01（2H，d，J = 8.0 Hz，H-3，5）。13C-NMR （acetone-d6，125 MHz）δ∶190.9（1-CHO），163.9 （C-4），132.7（C-2，6），130.3（C-1），116.6（C-3，5）。以上数据与文献［18］中一致，故鉴定为对羟基苯甲醛。

化合物 9 为淡黄色固体，ESI-MS m/z 137.01 ［M + H］-；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶8.5 ～10.0（2H，br s，-OH，-COOH），7.92（2H，d，J = 8.1 Hz，H-2，H-6），6.92（2H，d，J = 8.1 Hz，H-3，H-5）。13C-NMR（acetone-d6，125 MHz）δ∶167.6 （1-COOH），162.6（C-4），132.3（C-2，6），122.7 （C-1），116.0（C-3，5）。以上数据与文献［19］中一致，故鉴定为对羟基苯甲酸。

化合物 10 为黄色油状，ESI-MS m/z 314.15［M + H］+；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶8.17 （1H，br s，-OH），8.14（1H，br s，-OH），7.97 （1H，d，J = 8.2 Hz，-NH），7.45（1H，d，J = 15.6 Hz，H-3），7.16（1H，s，H-5），7.06（2H，d，J = 8.0 Hz，H-4'，H-8'），7.04（1H，d，J = 8.3 Hz，H-9），6.83（1H，d，J = 8.3 Hz，H-8），6.76（2H，d，J = 8.0 Hz，H-5'，H-7'），6.50（1H，d，J = 15.6 Hz，H-2），3.88（3H，s，6-OCH3），3.49（2H，d，J = 6.8 Hz，H-1'），2.75（2H，t，J = 6.8 Hz，H-2'）。13C-NMR（acetone-d6，100 MHz）δ∶166.4（C-1），156.8（C-6'），149.2（C-6），148.7（C-7），140.4（C-3），131.3（C-3'），130.6（C-4'，C-8'），128.4（C-4），122.6（C-9），120.2（C-2），116.2（C-8，C-5'，C-7'），111.3（C-5），56.3（6-OCH3），42.0（C-1'），35.9 （C-2'）。以上数据与文献［20］中一致，故鉴定为 N-阿魏酸酰-对羟基苯乙胺。

化合物 11 为淡黄色固体，ESI-MS m/z 252.98 ［M + H］+；1H-NMR（acetone-d6，400 MHz）δ∶7.57 （1H，d，J = 15.6 Hz，H-7），7.03（2H，s，H-2，H-6），6.41（1H，d，J = 15.6 Hz，H-8），4.20（2H，q，J = 7.1 Hz，H-10），3.90（6H，s，3-OCH3，5-OCH3），1.28（3H，t，J = 7.1 Hz，H-11）。13C-NMR（acetone-d6，100 MHz）δ∶167.5（C-9），149.1（C-3，C-5），146.0 （C-7），139.6（C-4），126.3（C-1），116.4（C-8），107.0（C-2，C-6），60.7（C-10），56.9（3-OCH3，5-OCH3），14.8（C-11）。以上数据与文献［21］中一致，故鉴定为芥子酸乙酯。

化合物 12 为白色粉末状固体，ESI-MS m/z 419.17 ［M + H］+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ∶6.47 （4H，s，H-2，6，2'，6'），5.38 （2H，br s，4，4'-OH），4.62（2H，d，J = 3.6 Hz，H-7，7'），4.17（2H，m，H-9b，9b'），3.79（14H，s，H-9a，9a'，3，5，3'，5'-OCH3），2.98（2H，br s，H-8，8'）。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ∶147.3（4C，C-3，5，3'，5'），134.5 （2C，C-4，4'），132.3（2C，C-1，1'），102.8（4C，C-2，6，2'，6'），86.3（2C，C-7，7'），72.0（2C，C-9，9'），56.6（4C，3，5，3'，5'-OCH3），54.5（2C，C-8，8'）。以上数据与文献［22］中一致，故鉴定为丁香脂素。

3　讨论

中药红花的主要成分为醌式查尔酮碳苷类化合物及其他黄酮类化合物。本实验分离得到的 12 个化合物主要为甾体和苯丙素类。我们推测在上述离体培养条件下，红花细胞中与醌式查尔酮碳苷类等化合物生物合成相关关键基因处于沉默状态所导致。通过在培养基中加入黄酮类化合物生物合成的前体乙酸钠、苯丙氨酸、酪氨酸，可以有效提高黄酮类目标化合物的产量［23］；在培养基中添加适度浓度的诱导子，如酵母提取物、真菌诱导子、茉莉酸甲酯等或进行转录因子调控［24］，激活相关沉默基因，增加基因的转录和表达，以促进红花愈伤组织进行醌式查尔酮碳苷类等化合物的生物合成。

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【Abstract】

ObjectiveTo investigate the chemical constituents from callus cultures of Carthamus tinctorius L.

MethodsCallus clutures of Carthamus tinctorius L. were scaled up using solid MS medium. Column chromatography on silica gel，Sephadex LH-20 and semi-preparative HPLC were used to separate and purify the compounds. Their structures were identified by analysis of MS and NMR spectroscopic data.

ResultsTwelve compounds were isolated from the cell cultures of C. ti nctorius L.， including stigmast-5-ene-3β-7β-diol，stigmast-5-ene-3β-7α-diol， stigmast-5，22-diene-3β-7β-diol， stigmast-5-ene-3β-7α-diol， hexadecanoic acid glyceride， methyl syringate，3，5-dimethoxy-P-hydroxybenzadehyde， P-hydroxybenzaldehyde， P-hydroxybenzoic acid， N-trans-feruloyl-tyramine， ethyl sinapate and syringaresinol.

ConclusionCompound stigmast-5-ene-3β-7β-diol， stigmast-5-ene-3β-7α-diol， stigmast-5，22-diene-3β-7β-diol， stigmast-5-ene-3β-7α-diol， methyl syringate， 3，5-dimethoxy-P-hydroxybenzadehyde， N-trans-feruloyl-tyramine and ethyl sinapate were isolated from this plant for the first time.

Author Affiliations： State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （TAN Zhen， CHEN Ri-dao， XIE Ke-bo， DAI Jun-gui）； College of Life and Environmental Sciences， Minzu University of China， Beijing 100081， China （YANG Lin）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：319-323

Chemical constituents from callus cultures of Carthamus tinctorius L.

TAN Zhen， CHEN Ri-dao， XIE Ke-bo， YANG Lin， DAI Jun-gui

Carthamus tinctorius；Cell culture techniques；Chemical constituents

DAI Jun-gui， Email： jgdai@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.006

国家自然科学基金（81573317）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2016CX14）

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所（谭圳、陈日道、解可波、戴均贵）；100081 北京，中央民族大学生命与环境科学学院（杨林）

戴均贵，Email：jgdai@imm.ac.cn

2016-02-05