脑红蛋白-中风及神经退行性疾病治疗的新靶点

黄建民 王凯华(通讯作者) 黄龙坚

广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 530011



·综述与讲座·

脑红蛋白-中风及神经退行性疾病治疗的新靶点

黄建民 王凯华(通讯作者) 黄龙坚

广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 530011

当脑组织受到亚致死性损伤时，会激活内源性保护通路来保护脑组织。随着大批的通过抑制缺血治疗中风的临床试验失败，通过内源性神经保护来治疗中风和神经退行性疾病似乎更有潜力和前景。脑红蛋白是一种与氧结合的球蛋白，在神经元内大量表达。众多证据表明，在体外培养及动物身上，脑红蛋白都是内源性神经保护分子，对脑缺氧/缺血、氧超载相关损伤及神经退行性疾病，如阿尔茨海默病均有保护作用。因此，上调内源脑红蛋白的表达将可能是一种治疗神经系统疾病的新疗法。本文总结了最近关于脑红蛋白的生物学功能、基因表达调控及神经元保护机制的研究。

脑红蛋白；神经元保护；中风；神经退行性疾病；缺氧/缺血

1 背景

在过去的20 a中，对于治疗中风及神经退行性疾病的神经保护剂进行了大量的临床研究，而结果大多让人失望。但其中也不乏一些有意义的研究，如有研究证明激活内源性保护机制可以预防或减轻脑损伤。内源性保护通路可被多种内源神经元保护分子激活，包括蛋白和一些转录因子，从而发挥保护作用[1]。脑红蛋白(Ngb)是一种与氧结合的球蛋白，在神经元内表达[2]。大量证据表明，在体外培养及动物身上，脑红蛋白是内源神经保护分子，对脑缺氧/缺血损伤有保护作用[3]。过表达Ngb基因能减轻缺血性卒中后组织损伤及功能损伤[4]，而下调Ngb的表达则增加缺氧缺血性脑损伤的程度[5]。此外，Ngb对β-淀粉样蛋白致阿尔茨海默病中退行性改变具有神经保护作用[6]。本文将回顾关于Ngb的生物学功能、基因表达调控及神经元保护机制的最新研究。

2 Ngb对缺血/缺氧所致神经损伤的保护作用

血红蛋白、肌红蛋白及细胞球蛋白等，都是与氧结合的球蛋白，在人体和某些动物体内发挥了重要功能。小鼠Ngb的蛋白序列和人有高达94%相似度，脑红蛋白在脑神经元中表达。此外，脑红蛋白还在周围神经系统、内分泌组织及视网膜中表达[7]。由于脑红蛋白在脑内能与氧结合的特性，据此研究者们推测，脑红蛋白可能具有治疗缺氧/缺血神经损伤的作用。而事实上已经有一系列的实验研究证明了这个推测[8]。

有研究报导，运用反义技术介导敲除Ngb基因后，皮层神经元在缺氧时更易受损伤。而上调表达Ngb能提高细胞在缺氧情况下的存活率[9]。在动物中风模型中，通过注射腺相关病毒过表达Ngb，可显著降低大鼠大脑中动脉闭塞模型中梗死的范围。Raida等[10]研究发现，在Ngb过表达的转基因小鼠内，闭塞大脑中动脉后的梗死面积比野生鼠缩少了约30%。国内也有研究者用转基因小鼠测试Ngb对局部短暂脑缺血模型的脑保护作用，结果与Raida等研究结果一致。进一步研究发现梗死面积缩少可持续至缺血后14 d，但具体的机制仍需进一步研究。

之前大多使用Ngb基因过表达的动物模型来研究Ngb神经保护作用，但从治疗的角度，则应在中风发生后再提高脑组织的Ngb蛋白水平。蔡等通过转录蛋白转染区的11-氨基酸HIV转录激活蛋白将Ngb蛋白分别在中风发生前后传送至小鼠脑组织(这种Ngb蛋白简称为TAT-Ngb)[11]；结果显示，在普通小鼠大脑中动脉闭塞模型中，中风前预先给TAT-Ngb和再灌注开始后马上给予TAT-Ngb都能有效地保护脑组织。但缺血发生2 h后再给药，已无明显获益。研究表明，Ngb过表达在中风早期的治疗可能是获益的，对中风高危人群，Ngb过表达也能达到预防作用。

3 脑红蛋白对神经退行性疾病及其他神经系统疾病的保护作用

作为脑内特异性的氧结合蛋白，脑红蛋白对其他神经系统疾病模型有保护作用并不足为奇。在体外培养的神经元细胞和阿尔茨海默病的小鼠模型，过表达Ngb都能抗β-淀粉样蛋白及NMDA的毒性，保护神经元。此外，母系遗传的新生癫痫大鼠，其小脑的Ngb表达上调，提示Ngb对癫痫也有神经保护作用[12]。最新的研究表明，Ngb过表达对眼内高压和青光眼导致的视网膜神经节细胞损伤有保护作用[13]。Ngb的适应证越广泛，表明它这个内源性保护因子的生理功能越重要，因此，任何可以上调内源性Ngb表达的策略都可能使病人获益。

4 Ngb对神经系统保护作用的分子机制

Ngb能保护缺氧/缺血所致的脑损伤已经是公认的，但是其作用机制却未被完全解开。初步研究表明，Ngb的作用机制可能与其跟氧和一氧化氮结合特性有关，另外还可能与其在信号转导的作用及对线粒体功能的影响有关。

4．1 Ngb能感测氧气浓度及抗氧化损害 从脑红蛋白结构来看，其细长的间质腔使氧气易于扩散至腔隙中并与血红素结合。起初许多人推测脑红蛋白的作用是储存和运输氧气。但脑红蛋白与氧气的结合率高而分解率却很低，而且脑红蛋白在脑内的浓度相对并不高。因此脑红蛋白的主要功能更可能是感测氧气，而非储存和运输氧气[14]。

另有研究指出，Ngb的神经保护作用与其能清除活性氧有关。Ngb能直接与一氧化氮(NO)结合，亲和力高且分解率低，通过与体内的NO进行结合并将其清除，起到抗氧化的作用[15]。Singh等[15]研究发现，过表达Ngb能使神经元中的线粒体处在NO诱导作用下的氧消耗率下降，包括减小细胞基本氧消耗率、质子渗透能力，与此同时加强呼吸储备的能力，从而抵抗NO诱导的神经细胞氧化损伤作用。另一方面，Tsio等[16]报道，Ngb可将硝酸盐转化成一氧化氮。可见，Ngb相当于受氧化还原反应调节的亚硝酸盐还原酶。除了可抑制通过NO诱导的氧化损害，实验发现Ngb的抗氧化保护作用还可能通过上调bcl-2基因的表达以及下调bax基因的表达，从而增加超氧化物歧化酶(SOD)的含量，使得体抗氧化水平上升，减少细胞色素C的释放以及caspase-3的活性，从而实现抵抗氧化作用对机体的损害[9]。Li等[17]实验结果显示，Ngb转基因小鼠的脑组织在缺血缺氧缺血时，其Ngb过表达，从而减少氧化应激作用促使氧化物质ROS和RNS的生成效应[18]。以上研究均表明，Ngb的作用不仅是生理性的氧化应激感受器，同时还可通过调节缺血缺氧时一系列的信号转导通路来抑制氧化损害反应。

4．2 Ngb参与调节信号转导 除了假设Ngb有感测O2和抗氧化损害的作用之外，也有假设指出Ngb是个信号转导因子。依据是在G蛋白与GDP结合的状态下，人三价铁脑红蛋白(met-Ngb)与G蛋白的α亚基结合，能激活鸟苷酸分解抑制剂(guanine-nucleotide dissociation inhibitor，GDI)，从而抑制GDP替换GTP，抑制Gα与Gβγ结合，从而激活了下游信号转导通路以缓解氧化刺激，而这一通路主要依靠Ngb分子中第60位的谷氨酸残基对GDI活性的调控作用加以实现的[19]。这一发现也证明了脑红蛋白是信号转导因子的假设。

研究[20]Ngb的超表达与神经元中线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放状态之间的关系发现，Ngb能减少氧糖掠夺(oxygen glucose deprivation，OGD)所诱导的mPTP开放，使mPTP更多的处于关闭状态，减少细胞色素C(Cytochrome C，CytC)的释放，使得受损的神经元的死亡信号转导受到抑制，发挥Ngb的神经保护作用。

另外，在阿尔茨海默病的动物模型上也发现了Ngb参与信号转导的证据。阿尔茨海默病的特征性标志是tau蛋白的过磷酸化作用。研究者发现，过表达Ngb或通过激活Akt信号通路，减弱tau蛋白的过磷酸化作用[6]。需要注意的是，这些只是关联性研究，Ngb与这些信号通路的联系可能是直接的，也可能是间接的。充分证明其直接因果关系的证据尚远远不足。但Ngb对中风和阿尔茨海默病有保护作用已然是不争的结论。

4．3 Ngb能维持线粒体正常功能 Ngb只表达于代谢活跃且耗氧的细胞中，与线粒体关系密切。线粒体的功能广泛，可以对多种细胞损伤作出应答。一方面，Ngb可如上所述，通过稳定线粒体上mPTP的功能，减少CytC的释放，然而Ngb与CytC对于细胞的综合作用两者之间的比值密切相关，研究发现，当hNGB/CytC比例至少是3：1时，hNGB才能下调凋亡通路的激活物caspase-3的活化，而当低于这一比例时，hNGB并未能体现出对caspase-3活化的抑制作用[21]。另一方面，Ngb对线粒体的作用还可以通过线粒体复合物得以实现。Yu等[22]利用酵母双杂交技术研究发现，Ngb可与CytC1进行结合，后者是线粒体复合物Ⅲ上的一个亚基，同时，他们在免疫电镜下观察发现，约10%的Ngb存在于原代培养的神经细胞的线粒体中，并且线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的活性随Ngb的含量下降而减弱，说明Ngb可通过线粒体复合物的结合对线粒体的生物学功能发挥作用。尚有研究表明，Ngb可促使氧向神经细胞中的线粒体内进行扩散，使ATP的产生量上升，从而起到对线粒体乃至神经细胞功能的维持作用[6]。

5 Ngb的表达及其基因表达的调控

5．1 Ngb在病理状态下表达的变化 Ngb大量存在于大脑皮质、海马、丘脑、下丘脑以及小脑[23]，Ngb蛋白分布基本与其mRNA分布相一致，说明上述组织也是表达Ngb的mRNA主要分布的地方。在缺氧/缺血状态下，Ngb的基因表达水平上升[24]。患母系遗传的癫痫乳鼠，其小脑的Ngb在癫痫导致的缺血-缺氧中表达上调。临床研究也表明，在中风病人梗死周围皮层区，Ngb表达升高[5]。Ngb表达上升是亚致死性缺血/缺氧损伤后的内源性代偿或保护机制。Ngb的除了在脑内分布，在视网膜细胞的表达水平非常高，还表达于各类肿瘤组织，包括恶性胶质瘤和星形细胞瘤。这些研究表明，Ngb在病理状态有更广泛的意义，提示Ngb可能与肿瘤细胞适应缺氧环境有关。

5．2 Ngb基因的转录调控机制 近来一些研究把重点放在影响Ngb表达的转录调控机制上。Zhang等报道，转录因子Sp1和Sp3能够结合到人Ngb启动子区域并激活Ngb的转录[25]。Ngb表达所需的转录因子有NFκB(p65、p50、cRel)、Egr1和Sp1。它们能结合到Ngb启动子并负责启动基础Ngb的表达。此外，NFκB(p65)、Sp1以及Hif1α对缺氧状态下Ngb表达也有作用[26]。这些研究结果有利于筛选出能上调Ngb表达的化合物。

5．3 能上调内源性Ngb表达的化合物 脑红蛋白一般位于细胞内，除了在斑马鱼外，脑红蛋白通常不能通过细胞膜，所以普遍认为外源性地给予脑红蛋白是不可行的。若能找出能上调内源脑红蛋白的小分子，或许就能通过这些小分子上调Ngb的表达并使其发挥脑保护作用，找到治疗中风和相关疾病的新方法。最近有研究报道，脑红蛋白能被某些化合物上调[27]。研究发现肉桂酸[11]和17β-estradiol(雌二醇)对均有上调Ngb的作用[28]。肉桂酸能降低谷氨酸对大鼠皮层神经元毒性[11]，但并不能保护OGD状态下的GT1-7细胞。另一研究肉桂酸对β-淀粉样蛋白在大鼠神经细胞株产生的毒性，结果也是对细胞无保护作用[28]。这些研究质疑肉桂酸对中风到底有没有保护作用，该质疑值得进一步研究。雌二醇虽既能上调Ngb的表达，又对神经损伤有保护作用[29]，但由于其潜在的致癌作用，因此将雌二醇用作保护神经药物也基本无望。此外，上述三种化合物能上调Ngb表达的作用都是在体外培养的神经元上发现，因此它们在动物模型身上是否有上调Ngb作用仍有待考究。虽然这些药物尚不能作为治疗中风及神经退行性病变的药物手段进入临床，但它们如何上调Ngb的机制值得进一步研究，而且它们还能作为对照药，筛选出更多能刺激脑红蛋白上调的化合物。

综上所述，众多的研究清楚地证明Ngb蛋白表达的上调对缺氧/缺血所致的脑损伤以及其他神经系统病变均有保护作用。因此以Ngb作为靶分子筛选出能上调Ngb表达的小分子，并建立筛选分子的策略，或许将有助于我们找出治疗中风和其他相关神经疾患的新方法。

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(收稿2016-04-25)

广西科技厅自然科学基金青年基金项目(2013GXNSFBA-19153)资助；广西中医药管理局中医民族医药传承创新专项(GZLC14-08)资助

R743.3

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1673-5110(2016)20-0134-03