胃癌中凋亡抑制蛋白的表达与化疗耐药的关系

曹晓静　白玉洁　宋晓翠　杜丽艳　杨德志　马超　宋晓昕　张春山

胃癌中凋亡抑制蛋白的表达与化疗耐药的关系

曹晓静白玉洁宋晓翠杜丽艳杨德志马超宋晓昕张春山

【摘要】目的探讨胃癌组织中Livin、Survivin的表达与化疗药敏性的关系。方法收集102例胃癌标本，用免疫组织化学检测Livin和Survivin的表达。新鲜胃癌组织制备单细胞悬液，分别加入6种化疗药物(奥沙利铂、氟尿嘧啶、顺铂、紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺)培养48 h，MTT法观察药物作用后癌细胞活性变化。结果Livin、Survivin在胃癌组织中表达明显高于组织(P＜0.05)。Livin在胃癌组织中高表达时，与奥沙利铂、氟尿嘧啶、顺铂耐药性有关(P＜0.05)。Survivin高表达时，对顺铂、阿霉素、环磷酰胺耐药性有关(P＜0.05)。结论肿瘤中Livin、Survivin的过表达与部分化疗药物耐药有关。

【关键词】胃癌;化疗药物; Livin; Survivin

【中图分类号】R 735.2

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2415－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.004

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression of Livin，Survivin and chemotherapeutic drug resistance in gastric cancer.Methods One hundred and two specimens of gastric cancer were colleted，and the expression levels of Livin，Survivin were detected by immunohistochemistry.The single cell suspension was prepared with fresh tumor tissue，then 6 kinds of chemotherapeutic drugs including oxaliplatin，fluorouracil，cisplatin，paclitaxel，adriamycin，cyclophosphamide were added into the suspension which was cultured for 48 hours，finally the changes of cancer cell activity were observed bymTT.Results The expression levels of Livin and Survivin in gastric cancer tissue were significantly higher than those of normal tissues(P＜0.05).The high expression of Livin in gastric cancer was correlated to the drug resistance of oxaliplatin，fluorouracil，cisplatin(P＜0.05).The high expression of Survivin was related with the drug resistance of cisplatin，adriamycin，cyclophosphamide(P＜0.05).Conclusion The overexpression of Livin，the and Survivin is correlated to the part of chemotherapeutic drug resistance in gastric cancer.

收稿日期:(2015－01－20)

作者单位: 054001河北省邢台市第一医院胃肠外科(曹晓静、宋晓翠、杜丽艳、杨德志、马超、张春山)，病理科(宋晓昕);河北省邢台市第二医院外科(白玉洁)

Study on the expression of Livin，Survivin and chemotherapeutic drug resistance in gastric cancer

CAO Xiaojing*，BAI Yujie，SONG Xiaocui*，et al.*Department of Gastrointestinal Surgery，The First Hospital of Xingtai City，Hebei，Xingtai 054001，China

【Key words】gastric carcinoma; chemotherapeutic drug; Livin; Survivin

在我国早期胃癌诊断率低，胃癌经常到晚期才得到诊断，因而化疗在胃癌治疗中占据非常重要地位。但化疗耐药性成为阻碍化疗效果提高的主要因素之一。胃癌耐药机制的研究一直是国内外的热点，细胞凋亡异常是耐药机制之一。我们选取102例胃癌组织和11例正常胃组织，检测了凋亡抑制蛋白Livin、Survivin的表达情况，并分析与6种常见化疗药物耐药性的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选择邢台市第一医院2010年6月至2012年6月间经手术切除胃组织标本102例，正常胃组织(非肿瘤性疾病)11例。其中男64例，女38例，男女之比为1.68∶1;年龄25～81岁，中位年龄58岁。所有标本均为手术切除新鲜组织标本。标本切下后，立即原发灶两个部位分别切取1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小组织块，置入双抗培养液行噻唑蓝(MTT)法肿瘤细胞化疗药物敏感性实验。另外每例新鲜组织标本使用中性甲醛溶液固定，再经石蜡包埋、切片，进行免疫组化检测。

1.2免疫组化法检测Livin、Survivin蛋白的表达兔

抗人Livin多克隆抗体、Survivin多克隆抗体分别购买于武汉博士德生物工程有限公司、Zemet公司。采用免疫组化过氧化物酶标记链霉卵白素法(SP)，Livin工作浓度为1∶50，Survivin工作浓度为1∶50。使用PBS溶液代替一抗做阴性对照，应用微波抗原修复。由两位经验丰富的病理科医生采用双盲阅片。每例每个指标随机取5个(×400)高倍视野，按照半定量积分方法记录结果。根据免疫组化染色反应的深度及阳性细胞的数量分别记分。无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75% 为3分，＞75%为4分。两项指标分值的成绩分为4级，0～1分为阴性(－)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3mTT药物敏感实验取新鲜标本制备胃癌细胞悬液。取胃癌细胞悬液加入培养板，每孔200 μg。用药组:分别加入药物终浓度为10倍血浆峰值浓度的6种化疗药物，分别是奥沙利铂(L-OHP)、氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(DDP)、紫杉醇(PTX)、阿霉素(ADM)、环磷酰胺(CTX)，每组设立3个复孔。对照组:不加药物的细胞。置于37℃、CO2培养箱中，培养48 h，各孔加入MTT(5 g/L)20 μl，继续培养4 h，终止培养后应用显微镜观察细胞变化。应用酶标仪570 nm波长处检测各孔吸光度值(A)。肿瘤细胞抑制率=(1－用药组平均A值/对照组平均A值)×100%。判断标准:当肿瘤细胞抑制率＜30%时为不敏感(耐药)，＞30%时为敏感。

1.4统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验、秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胃癌组织中Livin、Survivin的表达及意义显微镜下观察，Livin蛋白主要位于胃癌细胞的细胞质和细胞核，而Survivin蛋白主要位于胃癌细胞的细胞质，均表现为黄色或棕黄色颗粒。在102例胃癌组织中Livin、Survivin的表达明显高于正常胃组织(71.5%和76.5%，P＜0.05)。结果分析显示，Livin蛋白的表达和胃癌组织分化程度、有无淋巴结转移明显相关(P＜0.05)，但与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度及胃癌TNM分期临床病理因素无关(P＞0.05)。Survivin蛋白的表达与肿瘤分化程度明显相关(P＜0.05)。Survivin的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度及TNM分期临床病理因素无关(P＞0.05)。在选取的11例正常胃黏膜组织中，无Livin蛋白表达，但有1例胃组织Survivin表达阳性(9.1%)，经统计学分析，胃癌组织中Survivin蛋白的表达明显高于正常胃组织(P＜0.05)。见表1、图1～2。

表1　胃癌组织中Livin和Survivin表达及意义

图2　Survivin在胃癌组织的表达(SP×400)

图1　Livin在胃癌组织的表达(SP×400)

2.2胃癌中Livin、Survivin表达与化疗药物敏感性关系本实验MTT法药敏实验成功102例，应用化疗药物作用48 h后，观察可见细胞受损明显，表现为活动力的降低，数量的减少，失去贴壁能力，细胞内空泡增加，完整性受到破坏，形成细胞碎片。本次MTT检测结果显示，不同个体胃癌细胞对化疗药物敏感性不同。Livin阳性表达组中，奥沙利铂、氟尿嘧啶、顺铂对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(P＜0.05)，但紫杉醇对肿瘤细胞的抑制率则明显增加(P＜0.05)。在Survivin阳性表达组中，顺铂、阿霉素、环磷酰胺对肿瘤细胞的抑制率明显降低(P＜0.05)，但紫杉醇对肿瘤细胞的抑制率则明显增加(P＜0.05)。见表2。

表2　胃癌组织Livin、Survivin表达与化疗药敏的关系%，x±s

表2　胃癌组织Livin、Survivin表达与化疗药敏的关系%，x±s

临床病理因素Livin阳性　阴性　χ2值　P值Survivin阳性　阴性　χ2值　P值L-OHP耐药(n =31)　30　 1　 8.124＜0.05　 25　 6　 0.978　　＞0.05敏感(n =60)　43　 17　53　 7 5-Fu耐药(n =35)　32　 3　 10.328＜0.05　 24　 11　 1.848　　＞0.05敏感(n =67)　41　 26　54　 13 DDP耐药(n =33)　30　 3　 8.968＜0.05　 31　 2　 8.273　　＜0.05敏感(n =69)　43　 26　47　 22 PTX耐药(n =20)　11　 9　 3.356＞0.05　 12　 8　 3.751　　＞0.05敏感(n =82)　62　 20　66　 16 ADM耐药(n =36)　25　 11　 0.123＞0.05　 32　 4　 4.768　　＜0.05敏感(n =66)　48　 18　46　 20 CTX耐药(n =29)　20　 9　 0.153＞0.05　 27　 2　 6.230　　＜0.05敏感(n =73)53　 20　51　 22

3　讨论

胃癌在世界范围内国发病率和死亡率都很高。近年来，虽然胃癌的治疗取得了明显的进步，但在我国仍然是导致恶性肿瘤死亡的重要原因，胃癌的化疗耐药性是导致高死亡率的原因之一。胃癌耐药的主要机制之一细胞凋亡耐药。细胞凋亡耐药是指促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的过度表达导致肿瘤细胞耐受凋亡而对化疗耐药。近期研究发现，凋亡抑制蛋白(IAP)家族是具有重要的抗细胞凋亡作用，其中Livin和Survivin是重要凋亡抑制因子［1］，在许多恶性肿瘤中［2－7］，如胃癌、结直肠癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、白血病等，Livin均呈高表达。其作用机制直接或间接调控Caspase信号途径，破坏了细胞的增殖和凋亡之间的平衡，导致肿瘤发生、发展密切相关。而许多化疗药物作为细胞凋亡诱导剂，通过损伤细胞DNA，将信号经不同途径传递到凋亡控制点启动凋亡，经过一系列酶联反应，最终活化凋亡效应分子Caspase、切割DNA产生细胞凋亡发挥抗肿瘤作用［8］。由此，我们考虑到胃癌中Livin和Survivin的表达是否与化疗药物耐药性有关。我们研究检测了凋亡抑制蛋白Livin、Survivin在胃癌组织中的表达，并采用MTT法检测了胃癌细胞对常用的6种化疗药物的敏感性，分析其与化疗药物耐药性的关系。

我们的实验结果显示:在胃癌组织中Livin和Survivin的表达明显高于正常胃组织(P＜0.05)，Livin、 Survivin表达与肿瘤组织分化密切相关(P＜0.05)，另外Livin过表达与淋巴结转移还密切相关(P＜0.05)。研究说明，胃癌组织分化越差，Livin、Survivin的表达可能越高。Livin、Survivin的表达越高，使肿瘤细胞凋亡越不足，促使恶性转化的细胞异常增多，加速肿瘤发生、发展。

本研究一重要结果显示，在胃癌组织Livin高表达组中，与奥沙利铂、氟尿嘧啶、顺铂耐药性有关。Survivin高表达时，与顺铂、阿霉素、环磷酰胺耐药性有关。与有关的研究［9］一致，即Survivin高表达时，与顺铂、阿霉素耐药有关。由此可见，Livin、Survivin表达与部分化疗药物耐药性有关，可能是由于作用于凋亡通路不同位点导致效果不一。我们的研究是在体外进行的，即将化疗药物和肿瘤细胞在离体情况下充分接触，而药物在人体内分布状况、代谢规律、排泄速度和体外实验有很大差异。然而，许多研究已证实，体外药敏实验不敏感者，在体内用药也常常耐药。因此，我们希望通过更多更完善研究能够筛选敏感化疗药物，克服化疗药耐药性，指导肿瘤的临床用药。

参考文献

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