髓样细胞触发受体样转录因子-1的研究进展

陆丽丽综述， 刘 丹审校



髓样细胞触发受体样转录因子-1的研究进展

陆丽丽综述， 刘 丹审校

髓样细胞触发受体(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREMs)是免疫球蛋白超家族中的一个受体家族，人类TREMs基因簇定位于6号染色体的p21.1[1]。TREMs家族中的成员都含有特征性的单一V形细胞外免疫球蛋白结构域，一个短胞质尾区和一个含有赖氨酸残基的跨膜结构域，从而可以与酪氨酸激酶结合蛋白12(DNAX-activation protein of 12 kDa，DAP12)信号通路相连接[2]。不同于其他的TREMs家族成员，在髓样细胞触发受体样转录因子-1(TREMs like transcript-1，TLT-1)的胞浆结构域还包含一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，可以招募酪氨酸蛋白磷酸酯酶[3]，因此认为TLT-1是TREMs受体家族中的抑制性成员。已有研究表明，TLT-1可以调节血小板的活化和炎症反应[4]。缺乏TLT-1的小鼠表现为血小板的聚集能力明显受损，容易出现内毒素血症引起的败血症性休克[5]。目前，TLT-1的接头异构体与短胞浆结构域已经被报道[6]，这表明不同的TLT-1衍生物可能具有不同的细胞生物学功能。

1 TLT-1的一般特征和特异性表达

1.1 TLT-1的一般特征 TLT-1是TREMs家族中的一员，它们的基因共同存在于人类6号染色体和鼠的17号染色体上，所以TLT-1与TREMs具有显著的同源性，也具有单一V形细胞外免疫球蛋白结构域。但与TREM-1和TREM-2不同的是，TLT-1并不与DAP12相结合[1]。TLT-1的长胞质尾区由一个富含脯氨酸区域和一个典型的ITIM构成[7]。研究表明含有ITIM的受体可以抑制通过ITAM受体传导的信号[8]，DAP12就是一种ITAM依赖蛋白，而TREM-1和TREM-2又是通过与DAP12结合传递信号，所以TLT-1可能是TREM家族中的抑制性成员[9]。

TLT-1和CD62P共同存在于未分化骨髓来源的巨核细胞和巨核细胞来源的细胞内[4]，在体外用促血小板生成素(TPO)处理未分化的骨髓7～10 d后，通过运用共聚焦显微镜观察发现，有大量的未成熟巨核细胞生成，这些细胞的直径都是50～75 μm，并且含有丰富的α-颗粒和多叶的大细胞核，但是不能形成成熟的血小板[10]，这表明TLT-1和CD62P共同存在于这些早期的巨核细胞内。为了证明TLT-1在细胞生成的早期阶段就已经被组装运输到α-颗粒内，对经过抗TLT-1抗体处理过的骨髓进行染色后发现，有大量的预先组装的前TLT-1颗粒围绕在多叶的大细胞核周围，这些都说明TLT-1是在巨核细胞内生成和组装的。

1.2 TLT-1的特异性表达 TLT-1存在于巨核细胞和血小板的α-颗粒内，当血小板被凝血酶或脂多糖(LPS)激活时，TLT-1会特异性地表达于巨核细胞和外周血中血小板的表面，促进Ca2+的内流和血小板的聚集[5,6]，这表明TLT-1在止血和/或血栓的形成中起着独特的作用。既往通过Northern印记法显示，TLT-1与TREM-1的mRNA在未分化骨髓中呈共表达状态[3]。为了验证TLT-1是否在白细胞上表达，人们进行了许多实验[4]，首先通过比较鼠的骨髓细胞来源的树突状细胞和纯化的血小板中TLT-1和TREM-1 mRNA的表达水平，结果发现TLT-1在血小板上呈高表达状态，而TREM-1只在树突状细胞上有微量的表达。从小鼠外周血中提取mRNA进行分析，结果发现TLT-1信号的表达水平与骨髓密切相关，TLT-1的mRNA在外周血中呈高表达状态，但是在胸腺和淋巴结中没有表达。因此推测TLT-1可能只存在于外周血中的血小板和它的骨髓前体细胞上。Washington AV[4]及其同事还发现，血小板上存在两种抑制性受体，第一种是血小板内皮细胞粘附分子(PECAM);第二种就是TLT-1。虽然PECAM也在与内皮细胞上表达，但是TLT-1却只存在于血小板上，而不在内皮细胞上表达，所以TLT-1被称为血小板特异性的抑制性受体，TLT-1的表达的特异性使它称为巨核细胞和血小板的标志。

2 TLT-1及其衍生物的功能

2.1 TLT-1的功能 血小板的活化会引起α-颗粒内容物的释放，伴随着细胞表面的多种蛋白受体的表达也会的增加。这是因为血小板活化后α-颗粒膜会与细胞膜相融合，α-颗粒中的内容物也随之释放并表达于血小板表面，其中表达增加最明显的就是CD62P和TLT-1[11～13]。 研究发现，用LPS分别处理缺乏TLT-1的小鼠和野生型小鼠，结果表明缺乏TLT-1的小鼠的血浆中D-二聚体水平明显增高，血小板不能有效的聚集，出血时间明显延长，而且在内毒素血症时更容易死亡[5]。这表明机体在发生炎症反应时，TLT-1具有调节止血的作用。此外，TLT-1还可以增强大鼠噬碱性白血病细胞内的Ca2+信号，而TLT-1又不与DAP12活化链相结合，所以这表明TLT-1是一种共信号受体[6]。Giomarelli B[14]等研究发现，通过高度特异性的人单克隆抗体从丝状噬菌体表面筛选出的单链Fv片段(scFvs)能与TLT-1结合，抑制TLT-1的作用。抗TLT-1 scFvs能够抑制凝血酶介导的血小板聚集，而且这种抑制作用是特异性，在高剂量的激动剂的作用下这种抑制作用是可逆的。这可能为新的抗血小板治疗药物的研究提供了新的思路。

晶体研究发现[9]，TLT-1与TREM-1的结构相似，特别是它们胞质尾端的环形结构，这表明TLT-1与TREM-1之间存在相互作用，这可能揭示了血小板与骨髓细胞之间相互作用的一种新机制。TREM-1会放大感染或无菌性炎症，TREM-1水平的升高与急性炎症(如缺血再灌注、胰腺炎和出血性休克)或慢性炎症(如炎症性肠病、风湿性关节炎)有关。TLT-1与TLT-1来源的多肽能抑制TREM-1信号，显示出抗炎能力，因此TLT-1是TREM-1的天然的抑制剂[15]。

Louisa D[16]等研究发现TLT-1是一种新型的棕榈酰化蛋白，而且是cys196发生了棕榈酰化。TLT-1的全长有7个半胱氨酸残基，其中4个存在于胞外结构域形成二硫键，另外的3个半胱氨酸残基存在于细胞内，cys196正好在跨膜结构域之后。血小板上的许多棕榈酰化蛋白都被证实存在于脂质筏内，但是TLT-1却只有一小部分。这可能是由于免疫受体酪氨酸活化基序含有PECAM-1蛋白，所以TLT-1的棕榈酰化会影响其进入脂质筏。目前，关于棕榈酰化在TLT-1功能中的具体作用机制仍不清楚，但是棕榈酰化可能会影响TLT-1的磷酸化。

2.2 TLT-1s的功能 研究表明[17]，TLT-1s是TLT-1在巨噬细胞上的转录产物，TLT-1的全长由322个氨基酸构成，而TLT-1s可能只有202个氨基酸，与全长的TLT-1相比TLT-1s仅缺少N端的细胞外免疫球蛋白结构域，因此猜测TLT-1s可能是DAP12和FcRγ的真实调节分子。虽然TLT-1s有一个非常短的细胞外免疫球蛋白结构域，但是含有一个完整的跨膜结构域和含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的胞质尾区结构域。TLT-1基因由6个外显子和5个内显子组成，TLT-1s的基因位于TLT-1基因的2号内显子。TLT-1 和 TLT-1s表现为不同的组织分配模式，TLT-1在血小板和巨核细胞上大量表达，而TLT-1s却不在血小板上表达，TLT-1s只表达于巨噬细胞和破骨细胞上。含有ITIM的受体被证实可以通过招募磷酸酯酶(如SHP-1,SHP-2,和SHIP蛋白)来抑制依赖ITAM(受体酪氨酸活化基序)受体传导的信号。例如ITIM依赖性受体通过招募磷酸酯酶和共刺激受体去调节破骨细胞的生成[18,19]。对于破骨细胞的生成来说，ITAM对钙信号的调节是非常重要的。在缺乏ITAM信号调节者DAP12和FcRr的小鼠体内，因为破骨细胞的形成受损[20]，所以骨骼石化症非常严重；而SHP-1和SHIP-1被敲除的小鼠，因为破骨细胞的显著增生而患有严重的骨质疏松症[21，22]。TLT-1s会抑制破骨细胞前体细胞上的TREM信号，所以TLT-1s可能是侵蚀性骨病的一个特异性治疗靶点。

2.3 sTLT-1的功能 研究表明，血小板被激活后TLT-1在表达于血小板表面的同时，会裂解生成一种可溶性的TLT-1片段(sTLT-1)。sTLT-1存在于健康个体的血清而非血浆当中，但是在败血症或急性病毒感染的患者血浆中sTLT-1的水平会明显升高[23]，sTLT-1会促进血小板的聚集，加速血管损伤部位血液的凝固，在维持血管的完整性和止血方面起重要作用；而且sTLT-1的水平与败血症时弥散性血管内凝血(DIC)的发生密切相关[5]。DIC是败血症、心血管疾病和癌症等疾病的标志，Gladiany Ramos[24]等研究表明，sTLT-1表达水平的增加程度与DIC的病情严重程度一致。因为癌症与DIC的发生有关，所以检测癌症患者体内sTLT-1的表达水平可以在一定程度上反映DIC的严重程度，这也表明TLT-1在肿瘤的进展中发挥作用[25]。

Marc Derive[15]等研究发现sTLT-1通过抑制白细胞的活化和调节血小板与中性粒细胞的相互作用而参与败血症时炎症反应的调控。sTLT-1是TLT-1的一个胞外结构域，是一个含有17个氨基酸的序列(LR17)，通过竞争TREM-1配体而发挥作用。sTLT-1与sTREM-1的行为方式一致，能够特异性的调控TREM-1的活化，使细胞因子的产生减少，提高细菌的清除能力。TREM-1缺如的动物容易被多种细菌感染，早期或晚期用LR17治疗脓毒症小鼠可提高生存率。这表明血小板来源的sTLT-1是脓毒症相关性炎症反应的一个强有力的内源性调节器，为脓毒症相关的炎症反应的治疗开辟了新的前景。sTLT-1促进血小板的聚集是通过与纤维蛋白原结合，促进肌动蛋白的聚合进而促使血小板粘附于内皮细胞上。血小板与内皮细胞的粘附和趋化因子在内皮细胞表面的沉积，又会促进动脉粥样硬化的形成[26,27]。不稳定斑块的破裂会导致脂质核心暴露于血流中，触发血小板的粘附、聚集、释放的瀑布式反应，导致动脉粥样硬化性血栓的形成，因此sTLT-1可能是动脉粥样硬化性血栓形成过程中的一个推动者。

3 问题与展望

TLT-1的表达与血小板的活化密切相关，检测TLT-1的表达水平可以间接预测血小板的活化程度。在血栓相关性疾病中血小板的活化起重要作用，公认的脑梗死急性发病的病理基础是动脉粥样硬化性血栓形成，所以检测TLT-1在不同时期的表达水平可能为脑梗死急性发病的防治提供新的科学依据。当然，到目前为止这些还都是猜测，但是我们相信随着大量研究的开展、研究程度的不断深入以及研究手段的不断进步，TLT-1家族的成员、功能以及在疾病中的具体作用机制终将被揭示，并为相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的理论依据。

[1]Allcock RJ,Barrow AD,ForbesS,et al.The human TREM gene cluster at 6p21.1 encodes bothactivating and inhibitory single IgV domain receptors and includes NKp44[J].Eur J Immunol,2003,33(2):567-577.

[2]Daws MR,Lanier LL,Seaman WE,et al.Cloning and characterization of a novel mouse myeloidDAP12-associated receptor family[J].Eur JImmunol,2001,31(3):783-791.

[3]Washington AV,Quigley L,McVicar DW.Initial characterization of TREM-like transcript (TLT)-1,A putative inhibitory receptor within the TREM cluster[J].Blood,2002,100:3822-3824.

[4]Washington AV,Schubert RL,Quigley L,et al.A TREM family member,TLT-1,is found exclusively in the-granules of megakaryocytes and platelets[J].Blood,2004,104:1042-1047.

[5]Washington AV,Gibot S,Acevedo I,et al.TREM-like transcript-1 protects against inflammationassociated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans[J].J Clin Invest,2009,119(6):1489-501.

[6]Barrow AD,Astoul E,Floto A,et al.Cutting edge:TREM-like transcript-1,a plateletimmunoreceptor tyrosine-based inhibition motif encoding costimulatory immunoreceptor thatenhances,rather than inhibits,calcium signaling via SHP-2[J].Immunol,2004,172(10):5838-5842.

[7]Gattis JL,Washington AV,Chisholm MM,et al.The structure of the extracellular domain of triggering receptor expressed on myeloid cells like transcript-1 and evidence for a naturally occurring soluble fragment[J].Biol Chem,2006,281(19):13396-13403.

[8]Billadeau DD,Leibson PJ.ITAMs versus ITIMs:Striking a balance during cell regulation[J].ClinInvest,2002,109(2):161-168.

[9]Yoon SH,Lee YD,Ha J,et al.TLT-1s,alternative transcripts of triggering receptor expressed onmyeloid cell-like transcript-1 (TLT-1),inhibits the triggering receptor expressed on myeloid cell-2(TREM-2)-mediated signaling pathway during osteoclastogenesis[J].Biol Chem,2012,287(35):29620-29626.

[10]Cramer EM,Norol F,Guichard J,et al.Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand[J].Blood,1997,89:2336-2346.

[11]George JN.Platelets[J].Lancet,2000,355:1531-1539.

[12]Frenette PS,Denis CV,Weiss L,et al.P-Selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) is expressed on platelets and can mediate plateletendothelial interactions in vivo[J].Exp Med,2000,191:1413-1422.

[13]Geng JG,Chen M,Chou KC.P-selectin cell adhesion molecule in inflammation,thrombosis,cancergrowth and metastasis[J].Current Medicinal Chemistry,2004,11(16):2153-2160.

[14]Giomarelli B,Washington VA,Chisholm MM,et al.Inhibition of thrombin-induced platelet aggregation using human single-chain Fv antibodies specificfor TREM-like transcript-1[J].Thromb Haemost,2007,97:955-963.

[15]Marc D,Youcef B,Nacira S,et al.Soluble Trem-like Transcript-1 Regulates Leukocyte Activation and Controls Microbial Sepsis[J].Journal of Immunology,2012,188(11):5585-5592.

[16]Louisa D,Wei Y,Michael RF,et al.Proteomic analysis of palmitoylated platelet proteins[J].Blood,2011,118(13):e62-e73.

[17]Soo-Hyun Y,Yong DL,Jeongim H,et al.TLT-1s,Alternative transcripts of triggering receptor expressed on myeloid cell-like transcript-1 (TLT-1),inhibits the triggering receptor expressed on myeloid cell-2(TREM-2)-mediated signaling pathway during osteoclastogenesis[J].J Biol Chem,2012,287(35):29620-29626.

[18]Mori Y,Tsuji S,Inui M,et al.Inhibitory immunoglobulin-like receptors LILRB and PIR-B negatively regulate osteoclast development[J].Immunol,2008,181:4742-4751.

[19]Hayashi M,Nakashima T,Kodama T,et al.Ly49Q,an ITIM-bearing NK receptor,positively regulates osteoclast differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,393:432-438.

[20]Zou W,Zhu T,Craft CS,et al.Cytoskeletal dysfunction dominates in DAP12-deficient osteoclasts[J].Cell Sci,2010,123:2955-2963.

[21]Bauler T,Kamiya N,Lapinski PE,et al.Development of severe skeletal defects in induced SHP-2-deficient adult mice.A model of skeletal malformation in humans with SHP-2 mutations[J].Dis.Model Mech,2011,4:228-239.

[22]Aoki K,Didomenico E,Sims N A,et al.The tyrosine phosphatase SHP-1 is a negative regulator of osteoclastogenesis and osteoclast resorbing activity.Increased resorption and osteopenia in me(v)/me(v) mutant mice[J].Bone,1999,25:261-267.

[23]Jessica M,Karina V,Jim G,et al.Soluble TLT-1 modulates platelet-endothelial cell interactions andactin polymerization[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2010,21(3):229-236.

[24]Gladiany R,Yaliz L,Giovanni O,et al.The addition of a pregnenolone pendant group enhances the anticancer properties of titanocene dichloride in a MCF-7 xenograft model[J].Anticancer Res,2014,34(4):1609-1615.

[25]Pelham CJ,Pandya AN,Agrawal DK.Triggering receptor expressed on myeloid cells receptor family modulators: a patent review[J].2014,24(12):1383-1395.

[26]Huo Y,Schober A,Forlow SB,et al.Circulating activated platelets exacerbate atherosclerosis inmice deficient in apolipoprotein E[J].Nat Med,2003,9(1):61-67.

[27]Schober A,Manka D,von HP,et al.Deposition of platelet RANTES triggering monocyterecruitment requires P-selectin and is involvedin neointima formation after arterial injury[J].Circulation,2002,106(12):1523-1529.

1003-2754(2016)10-0952-03

R744.1

2016-08-10；

2016-09-29

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010)

刘 丹，E-mail：liudanbaotou2313@163.com

综 述