光遗传学技术在听觉研究中的应用

刘晨 于宁

中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科 耳鼻咽喉研究所

·综 述·

光遗传学技术在听觉研究中的应用

刘晨 于宁

中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科 耳鼻咽喉研究所

光遗传学以其基因编码，单一成分以及可以在复杂的组织中调控特定细胞的特点已经在神经科学研究中产生了深远的影响。随着光敏感蛋白的不断优化和多样化，各个生命科学领域都在尝试使用这一先进的技术手段解决问题。声音信号在耳蜗内经过毛细胞换能后在螺旋神经节编码成电信号传入中枢。听力受损后，通过人工耳蜗的电极刺激螺旋神经节可以部分地恢复一定的听力，但会影响声音的分辨率。光学刺激选择性聚焦可以改善电刺激的局限，增加声音编码的分辨率。本文回顾了光遗传技术在听觉研究中的应用以及在未来科学研究和临床转化的前景。

光遗传学;螺旋神经节;听觉系统

This work was supported by grants from the National Basic Research Program of China(973 Program)(#2012CB967900 and 2014CB943002),PLA Medical Technology key project of scientific research（BWS14B080、JDZYY20132），the National Natural Science Foundation ofChina (NSFC #81271081、81528005 and 81470700)，Beijing MunicipalScience and Technology Project（PXM2014-178304-000002-00130228）

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

1 光遗传学的基本概念

光遗传是一项非常精确的技术手段，它可以快速定向控制自由活动的复杂生物系统。光遗传结合了遗传学和光学实现加强或减弱活组织内特定细胞的功能。其核心技术是传递效应功能和控制光敏感靶点，以毫秒级的速度将光刺激传递到待研究组织，锚定目的细胞，获得荧光表达图像和电生理数据[1]。

早在1979年，Francis Crick指出神经科学家需要在调控所指定的细胞同时不干扰其他细胞的技术手段，并最早推测光学可以实现这个想法[1]。但当时的技术比较局限，随着技术的发展，光遗传学技术的发现实现了这一目标且最早应用于神经科学，介于其特异性高的独特优势，很快被各个领域采纳。

2 微生物视蛋白的发现和光电极的起源与应用

光遗传的工具蛋白主要有:①视紫红质通道蛋白（Channelrhodopsins，ChR）；②盐细菌视紫红质（Halorhodopsins）；③G蛋白偶联受体-视紫红质嵌合体（OptoXRs are rhodopsin-GPCR）[2]。

光遗传首次应用在听觉研究中是利用蓝光照射螺旋神经节上表达的ChR2（channelrhodopsin-2），使其被激活并产生动作电位。随后相继应用于耳蜗核、耳蜗核神经和听觉中枢神经。光敏感通道蛋白ChR2是2005年德国海泽曼和纳高的团队发现的阳离子通道蛋白，在接收到一个光子的能量后迅速产生对一价阳离子和二价阳离子的高通透性。直至2010年才有研究陆续证明紫红质通道蛋白、细菌视紫红质和盐细菌视紫红质在表达后都可以通过不同波长的激发光来激活或抑制神经元。2007年，随着光纤和激光二极管的应用，光遗传技术实现在可涉及大脑深部结构的同时保持动物处于自由活动的状态。进而研发的光电极（光纤和电极紧密整合体）可以在快速光刺激信号输出的同时同步获取细胞输出信息。起初因为偶然多余或丢失的动作电位，研究者们对光遗传调控的精确性并不完全认可，随着研究多种视蛋白的融合或突变，视蛋白的表达水平以及其生物特性逐渐清晰，调控的精确性显著提高。光刺激代替电刺激可以突破电极的设备局限实现刺激时同步记录。目前光遗传技术已经趋于成熟，转基因动物和病毒转染[3]都可以使ChR2蛋白在听觉神经上表达，在低强度光照刺激下被激活[4]。未来应用设备和系统的升级和优化会继续推动着光遗传的技术不断革新。

3 ChR2在听觉通路上的表达

目前已经通过体内和体外的光刺激实验以及电生理记录结果证实光遗传技术产生动作电位的条件有二：一是螺旋神经节和足够数量的耳蜗核神经有紧密连接，二是足够强度的光刺激光敏感蛋白ChR2。病毒转染可以有效的将光敏蛋白表达在目的细胞上，且有研究[5，6]证实病毒介导的视蛋白表达并不损伤听觉系统。

表达ChR2的转基因Thy1-ChR2-YFP小鼠[7]和WistarThy-1.2 promoter-Channelrhodopsin 2-Venus大鼠[8]模型显示，ThY1.2启动子[9]特异性引导ChR2在听觉通路上表达，但是不能忽视光刺激激活非听觉神经元细胞的非特异性表达。选择性表达视蛋白是在听觉系统上进行光遗传技术操作的关键。病毒衣壳的选择特异性，转基因的启动子以及病毒转染的时间和转染靶点是听觉研究中应用光遗传学的基础。在众多测试过的病毒当中，腺相关病毒(AAV,ad⁃eno-associated virus)在耳螺旋神经节上转染效果最好，同样也适合转染耳蜗核神经元。AAV转染的基因片段尽管不能整合进入基因组，但是可以保持视蛋白在一次注射后在目的细胞上较长时间的表达（至少18个月），同时不引起任何明显的神经毒性。含有特定基因片段的AAV试剂能够优化不同细胞型的特异性转染。到目前为止，临床试验中AAV携带基因经视网膜下注射转染人眼已经被证实是安全有效的[10]。

4 听觉系统定制的光刺激策略

光刺激能够形成闭合环路，优化的空间选择性和细胞选择性，减少来自点记录的干扰，非常适合未来改进人工耳蜗。耳蜗内刺激需要充分了解耳蜗的解剖结构，高分辨率的X线断层摄影技术和三维重建可以帮助获取这些信息[11]。光源可分为植入生物体内并在体内发光的内部光源和从体外引导进入体内的外部光源。听觉光遗传的研究中，将记录电极、光纤和微发光二极管结合在一起，同时进行单通道刺激和电生理记录。这种方法明显优于电刺激记录设备的是光源和组织的充分分离，增大了其与健康组织的兼容性和稳定性。薄膜发光二极管能够设置发出不同波长的光源，同时具备小型化，低耗能，高效能的特点。通过微型发光二极管（uLED，mi⁃croscale light emitting diodes）的曲面与显微镜头结合进行瞄准和聚焦。光电学和材料学的进展为此研究提供了必要的技术基础。未来长期的动物实验以及临床转化都需要长期稳定地发展这些技术。光纤-电极这一混合设备可以进行光刺激和电刺激的比较研究，并且支持未来设计制作光学的人工耳蜗。

在基础研究和未来临床转化中，光强的敏感度是多通道光刺激听觉通路的另一重要条件。想要升级到多通道需要光照脉冲的低耗能和足够长的电池寿命，这在动物行为学实验中是至关重要的。螺旋神经节光刺激的能量阈值是由听觉脑干诱发电位的方法测量的，光刺激的能量阈值大约是2μJ/mm2[12]，其需要低于红外线刺激的阈值能量16–150 μJ/mm2[13],但是高于临床中应用的人工耳的每次脉冲能量0.2 μJ/mm2[14]。未来研究的工作重点是测量出并且尽可能降低多通道光遗传刺激中每次脉冲激活每个通道蛋白的能量阈值，同时需要对ChR蛋白本身及其表达进一步优化。

5 光遗传学在听觉系统应用的优越性

在听觉通路的研究中，声刺激和电刺激已经成功应用于阐述听觉产生机制的研究，但是两种方式存在着各自不同的缺点。声音刺激会受到耳蜗微机械力学的影响，以及蜗轴不同位置对刺激等级敏感度不同，最终干扰了声音编码的频谱分辨率和螺旋神经节激活的独立性。因此，研究听觉皮层时选择刺激类型时一定要具有特异的适应性[15]，而且大脑解读在振幅调节下的复杂声音时会受到耳蜗本身机理的限制[16]。人工耳蜗是通过电刺激直接兴奋螺旋神经节来恢复耳聋个体的语言理解能力[17-23]。但是由于电极接头处产生的宽电流导致沿蜗轴的大量螺旋神经节非特异兴奋，导致人工耳蜗编码声音频率和强度的分辨率降低[7-9]。通过光遗传学的研究证明，对螺旋神经节进行聚焦光学刺激可以达到生理声音编码的精准度。光遗传技术可以灵活的在耳蜗和中枢听觉通路中精确的选择刺激时间和刺激位点，为研究听觉的正常功能以及异常功能提供了更多机会。

在电子耳蜗电极和电子编程没有错误的情况下，耳聋患者单音节的言语识别平均大约在58%[24]。最近研究新型光敏蛋白能具有强自适应性，能够接收高保真编码的快速光脉冲刺激，其频率符合人工耳蜗植入的频率范围（言语形成策略，250次/秒，2010人工耳蜗植入指南）。在与原声的直接对比中，光敏感蛋白体在激发频率适应性、瞬间编码以及高频刺激下的所有神经元的反应性上都体现出卓越的优势[25]。

6 光遗传学在听觉通路研究的应用前景

目前全球有超过3亿6千万-世界人口的5%的人患有听力障碍（hearing impairment，HI）[26]，失去听力可以导致抑郁和社会工作能力的减退，严重影响了生活质量。基于药理学的病因治疗，基因治疗以及干细胞移植等主流治疗研究方向尚不能解决耳聋问题。助听器、人工耳蜗植入和听觉脑干植入等这些先进的治疗技术均可以恢复部分听觉，但只能满足基本的生活需求。目前最主流的人工耳蜗植入的原理是绕过丧失功能的耳蜗电极直接刺激螺旋神经节，效果显著，开启了人工听觉的新时代[18,20,21]，是目前最成功的植入假体。听觉脑干植入电极刺激耳蜗核的康复效果也是颇见成效的。听觉植入已经成为目前听觉康复研究的主要工具[22]。然而，目前临床上应用的人工耳蜗由于电极接头周围宽泛的电流传导导致了通道之间的相互影响[23，27]。因此，人工植入患者在复杂噪声的环境中言语识别能力受到影响，最典型的例子就是无法欣赏音乐。提高听觉编码频率和强度的分辨率是改善人工耳蜗的核心问题，目前改善分辨率的研究包括多极的刺激[28]，神经内的电极[29]，以及促使神经突触朝向人工耳蜗电极接头的方向生长[30]等最受期待的是光遗传学中的光刺激效果[31]当前的研究工作证明了光遗传技术应用于听觉的可行性，但从科研实验转化为临床应用仍需大量工作。有学者提出，在基础研究向临床转化的工作中，也应该考虑非病毒转染如通人工耳蜗电极的电穿孔等新技术的尝试[32]。此外，伴有大部分螺旋神经节丢失的耳聋病人可以选择移植干细胞衍生的耳神经前体细胞[33]。螺旋神经节内神经元是听觉系统传入通路的起始细胞，光刺激能够帮助检测移植细胞功能和优化再生的螺旋神经节，确保移植或者再生神经元的有效功能，从而大大提高人工耳蜗的精准度。

光遗传学在听觉研究和听觉修复领域将成为非常有价值的技术选择。ChR蛋白在啮齿动物听觉系统的表达已获得成功，但是基本都是通过AAV转染获得，随后还需要进行功能检测和组织学上的纵向研究，如基因片段载体的选择及其辅助技术的研究来适应其他物种的研究，例如非人类的灵长类，为以后临床前期实验做好准备。发展耳蜗和中枢听觉中的光遗传技术需要多学科共同努力，uLED有希望成为最早应用于耳蜗植入的光学技术，但完全应用于临床实验还须进一步证实光遗传学植入的可靠性和安全性。

光遗传刺激对能量消耗，生理结构的要求以及刺激频率和强度的分辨率上都优于声学和电学。未来光遗传在听觉通路中的应用除了电生理记录还需要进行包含听觉认知方面的行为学实验和描述频率和强度的分辨率的表达方式。这些研究为听觉功能革新性的进展提供了基础，并且为听觉修复铺开一条独具匠心的道路。

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Applications of optogenentics in auditory research

LIU Chen,YU Ning
Department of Otolaryngology,Head&Neck Surgery,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China.

Optogenentics involves genetic coding,features a single-component approach and can modulate selected cells in complex tissues.It has made a profound impact on neuroscience research.As opsins continue to be optimized and diversified,application of optogenetic tools has been attempted in every field of life science to different organism models. Sound signals are transduced via hair cells in the cochlea,encoded as electric signals by spiral ganglion neurons(SGNs), and eventually transmitted to the auditory center.In individuals with deafness,hearing can be partially restored by electric stimulation of SGNs,although sometimes with poor temporal and intensity resolution.Optical stimulation can be selectively focused,which may greatly improve the resolution of sound coding compared to electric stimulation.This paper reviews applications of optogenentic technology in auditory research and its potentials in future scientific research and clinical utilities.

optogenentics;Hearing system;spiral ganglion neurons

R764

A

1672-2922（2016）06-837-4

2016-10-06审核人：郗昕）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.026

本文由国家973计划重大科学研究计划干细胞项目（2012CB967900与 2014CB943002）、军队项目（BWS14B080、JDZYY20132）、国家自然基金项目（81271081、81528005与81470700）及北京市项目（PXM2014-178304-000002-00130228）共同支持下在解放军总医院完成。

刘晨硕士研究生，医师，研究方向：军事噪声防护，光遗传学在听觉系统中的应用

于宁，E mail:yuning12@sina.com