白细胞介素10上调表达对家兔慢性细菌性鼻窦炎黏膜创伤修复的影响△

孙希才　李晗　王欢　王晶晶　胡俐　宋小乐　于华鹏　马娜　王德辉



·基础研究·

白细胞介素10上调表达对家兔慢性细菌性鼻窦炎黏膜创伤修复的影响△

孙希才李晗王欢王晶晶胡俐宋小乐于华鹏马娜王德辉

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031

【摘要】目的观察上调白细胞介素10(IL-10)的表达对家兔慢性细菌性鼻窦炎动物模型上颌窦黏膜创伤修复的影响。方法以慢病毒(LV)为表达载体，上调IL-10的表达(LV-IL-10)。实验分3组：生理盐水注射组、LV-IL-10治疗组和LV-GFP注射组(GFP为绿色荧光蛋白)。制作家兔慢性细菌性鼻窦炎模型。在创伤前3 d，各组上颌窦内侧壁黏膜下分别注射生理盐水、LV-IL-10和LV-GFP。于创伤后第3天和第10天取再生的上颌窦内侧壁黏膜，用实时聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验分别在mRNA水平和蛋白水平检测相关细胞因子的表达。苏木素-伊红(HE)染色和Masson三染色法观察创伤后第10天再生黏膜的形态特征。结果在创伤后第3天和第10天再生的上颌窦黏膜中，LV-IL-10治疗组的胶原沉积明显减少，炎症反应较轻，且IL-6以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达水平明显下降。 IL-6、IL-8以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平也明显下降，但3组间再生的上颌窦黏膜中转化生长因子β(TGF-β)mRNA的表达无明显差别。结论在家兔慢性细菌性鼻窦炎创伤修复的动物模型中，上调IL-10的表达可以抑制再生黏膜中的炎症反应，减少胶原沉积，改善再生黏膜的组织重塑。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：10-15)

【关键词】慢性鼻窦炎；创伤修复；白细胞介素10；慢病毒载体；兔

内镜鼻窦手术(endoscopic sinus surgery, ESS)已经成为治疗慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis, CRS)最主要的一种手术方法[1]。术后鼻腔瘢痕粘连形成是影响ESS效果的主要因素之一。额窦手术后窦口再狭窄的发生率达10%～15%[2-4]，上颌窦口的再狭窄以及前筛中鼻甲与鼻腔外侧壁之间的粘连发生率为1%～36%[5-7]。上调白细胞介素10(interleukin 10, IL-10)的表达可以抑制皮肤创伤修复过程中的瘢痕形成[8]。本研究以慢病毒(lentiviral vector, LV)作为表达载体，使得上颌窦黏膜中的IL-10高表达，观察其在家兔慢性细菌性鼻窦炎动物模型上颌窦黏膜创伤修复中的作用。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.1.1主要试剂美国模式菌种收藏所(ATCC)标准菌株Ⅲ型肺炎链球菌(编号：49619)由本院检验科微生物实验室馈赠。慢病毒载体：Pwpxl-MOD； DH-5alpha感受态(Invitrogen公司)；IL-10上游引物选用BamHⅠ，下游引物选用SalⅠ。IL-10-BamH I:AATTCGGGATCCatgcacagctcagcactg；IL-10-Sal I:ATTG-ACGTCGACttagctttttatctt，设计好的引物送Invitrogen公司合成。包装细胞293T细胞株(ATCC)；鼠源单克隆Anti-CD45(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司)；羊抗鼠荧光二抗594(Molecular Probes公司)；DAPI(Sigma公司)；酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，IL-6、IL-8、IL-10、Ⅰ型和Ⅲ型胶原均购自Uscn Life Science Technology Company。

1.1.2主要仪器聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(eppendorf公司)；电泳仪(Bio-rad公司)；荧光倒置显微镜(奥林帕斯公司)；冷冻超速离心机(Hitachi公司)；凝胶成像仪稳压DNA电泳仪(Tianneng公司)；数码凝胶处理系统(天能科学仪器公司)；电热恒温水浴箱(上海福玛实验设备有限公司)；实时PCR仪(ABI7300，应用生物仪器公司，美国)；旋涡振荡器(FS-1，武汉瑞华仪器厂)；生物安全柜(BHC-1100ⅡA2，阿尔泰实验室设备有限公司)。

1.2方法

1.2.1家兔慢性细菌性鼻窦炎及创伤修复模型的制作家兔动物级别：普通级，共30只，体重2 kg左右。实验前动物于本院动物实验中心在标准环境下饲养1周。分组：采用随机数字表对30只家兔进行分层随机分组：①生理盐水注射组；②LV-IL-10注射组；③LV-GFP注射组(GFP为绿色荧光蛋白)。每组进一步分为术后3 d和术后10 d组。每组各5只。

家兔慢性细菌性鼻窦炎模型的制作：氯胺酮(35～50 mg/kg)+赛拉嗪(甲苯噻嗪5 mg/kg)肌内注射麻醉；头面部中线垂直切口长约2.5 cm，分离上颌窦表面皮肤和骨膜，暴露上颌窦前壁；磨除上颌窦前壁骨质；定位上颌窦内侧壁自然开口，用棉花将其阻塞；缝合切口。术后第1天，于上颌窦前壁向上颌窦内注射Ⅲ型肺炎链球菌菌株1 mL，浓度3×108/mL。然后，在标准环境下继续饲养3个月制成慢性细菌性鼻窦炎动物模型。

家兔慢性细菌性鼻窦炎创伤修复模型的制作：将上述饲养3个月制成的慢性细菌性鼻窦炎动物模型沿原切口切开皮肤，去除上颌窦前壁的肉芽，暴露上颌窦腔，根据实验分组分别于上颌窦黏骨膜下注射生理盐水、LV-IL-10和LV-GFP，各约200 μL(其中，LV-IL-10组200 μL液体中病毒颗粒总量为2×108个)，缝合皮肤切口。3 d后，沿原切口再次切开上颌窦前壁皮肤，定位上颌窦内侧壁，并用直径为4 mm的电钻于上颌窦内壁上造孔，缝合皮肤，送回动物实验中心继续饲养用于后续实验。1.2.2慢病毒表达载体的构建慢病毒载体为Pwpxl-MOD，从家兔脾脏组织获取IL-10基因模板并进行扩增，对空载体Pwpxl-mod和PCR的回收产物用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌；重组质粒酶切鉴定；将载体进行测序，确定测序结果与IL-10 mRNA的基因序列基本吻合。病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、干扰质粒。慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为0.5×109/L时，接种于25 mL的15 cm细胞培养皿。当细胞密度达60%～70%时转染。实验最终获得滴定病毒颗粒总量为2×109个，总液体量为2 mL。

1.2.3免疫组织化学和Masson三染色实验鼠源单克隆Anti-CD45作为一抗，冷冻切片免疫组织化学法检测各组黏膜标本中白细胞的浸润情况。Masson三染色实验，分组同上。首先将上颌窦黏膜标本用石蜡固定，切片脱蜡至蒸馏水；苏木素染5～10 min，1%盐酸乙醇分化，蒸馏水洗至切片变蓝。丽春红酸性品红液染3～5 min，蒸馏水速洗。1%磷钼酸水溶液作用5 min。倾去磷钼酸，不用水洗，直接用2%亮绿液染3～5 min。0.5%冰醋酸冲洗切片。95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.4再生的上颌窦黏膜中胶原以及细胞因子的表达检测分别于创伤后3 d和10 d取再生的上颌窦黏膜，实时PCR法在mRNA水平检测IL-6、IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。ELISA在蛋白水平检测IL-6、IL-8、IL-10、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达，具体操作步骤根据产品说明书进行。

1.3统计学处理应用SAS9.1对实验数据进行统计分析。Student-Newman-Keuls检验用于统计分析术后3 d和术后10 d各分组间IL-6、IL-8、IL-10及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1家兔慢性细菌性鼻窦炎模型将家兔上颌窦自然开口阻塞，注入Ⅲ型肺炎链球菌，5 d左右开始出现鼻腔脓性分泌物。3个月时，上颌窦内仍充满脓性分泌物，鼻窦黏膜增厚水肿(图1)。

图1.家兔慢性细菌性鼻窦炎动物模型A.术后3个月，双侧上颌窦中的脓性分泌物；B.术后3个月，手术显微镜下观察增厚、水肿的上颌窦黏膜；C.家兔慢性细菌性鼻窦炎上颌窦黏膜的苏木素-伊红染色，可见大量腺体增生，黏膜呈慢性炎性改变(20×)

2.2IL-10治疗对炎症细胞浸润的影响创伤后3 d取再生的鼻窦黏膜，通过免疫荧光组织化学法检测白细胞共同抗原CD45,观察再生黏膜中的炎性细胞浸润情况，LV-IL-10治疗组再生的上颌窦黏膜中炎性细胞染色明显较低(图2)。

图2.创伤后3 d不同分组CD45免疫荧光染色示再生上颌窦黏膜中白细胞浸润情况A.生理盐水注射组(20×)；B.LV-IL-10治疗组(40×)；C.LV-GFP注射组(20×)；红色示CD45染色，蓝色示细胞核染色

2.3IL-10治疗对再生上颌窦黏膜中胶原沉积的影响分别于创伤后3 d和10 d取再生的上颌窦黏膜，在mRNA水平和蛋白水平检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达情况(图3)。

与生理盐水组和LV-GFP组相比，LV-IL-10治疗组，创伤后3 d和创伤后10 d再生上颌窦黏膜的Ⅰ型胶原mRNA(P值分别为0.001 7、0.006 6)和蛋白(P值分别为0.008 5、0.003 0)的表达均明显降低，Ⅲ型胶原mRNA(P值分别为0.025 6、0.007 0)和蛋白(P值分别为0.012 2、0.039 6)的表达均明显降低，但生理盐水组与LV-GFP组间Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4IL-10治疗对再生上颌窦黏膜中促炎细胞因子和促纤维化因子表达的影响于创伤后3 d和10 d，取再生的上颌窦黏膜在mRNA水平检测IL-6、IL-10、TGF-β的表达，在蛋白水平采用ELISA检测IL-6、IL-8、IL-10的表达(图4)。

图3.创伤后3 d和10 d各组再生上颌窦黏膜中胶原的表达A.Ⅰ型胶原mRNA的表达；B.Ⅲ型胶原mRNA的表达；C.Ⅰ型胶原蛋白的表达；D.Ⅲ型胶原蛋白的表达

图4.创伤后3 d和10 d各组再生上颌窦黏膜中细胞因子的表达A.IL-6mRNA的表达；B.IL-10 mRNA的表达；C.TGF-βmRNA的表达；D.IL-6蛋白的表达；E.IL-8蛋白的表达；F.IL-10蛋白的表达

与生理盐水组和LV-GFP组相比，LV-IL-10治疗后，创伤后3 d和创伤后10 d再生上颌窦黏膜IL-6 mRNA(P值分别为0.035 4、0.033 2)和蛋白(P值分别为0.018 2、0.000 2)的表达均明显降低， IL-8蛋白的表达明显降低(P值分别为0.003 0、0.023 0)，IL-10 mRNA(P值分别为0.023 2、0.003 3)和蛋白(P值分别为0.002 1、0.028 9)的表达均明显上升，但生理盐水组与LV-GFP组间IL-6 mRNA和蛋白、IL-10 mRNA和蛋白、IL-8蛋白的表达差异均无明显统计学意义(P>0.05)。

生理盐水组、LV-GFP组和LV-IL-10治疗组间，两两比较，创伤后3 d和创伤后10 d再生上颌窦黏膜TGF-βmRNA表达差异均无统计学意义(P值分别为0.796 4、0.947 6)。

2.5再生的上颌窦黏膜组织学特征创伤后10 d，取再生的上颌窦黏膜行苏木素-伊红(hematoxylin eosin, HE)和Masson三染色法，观察各组再生上颌窦黏膜的形态特征和固有层中的胶原沉积(图5)。

图5.不同分组再生的上颌窦黏膜中胶原沉积情况A.生理盐水注射组Masson三染色；B.生理盐水注射组HE染色；C.LV-IL-10治疗组Masson三染色；D.LV-IL-10治疗组HE染色；E.LV-GFP注射组Masson三染色；F.LV-GFP注射组HE染色；蓝色示胶原沉积(20×)

3讨论

目前，针对CRS术后鼻窦黏膜创伤修复的研究主要分为2个方面：①临床现象的描述及修复阶段的划分[2-3]；②一些生物材料及生长因子用于抑制术后瘢痕的形成，如透明质酸及胰岛素样生长因子1等[4-7]。从炎症角度去研究鼻窦黏膜创伤修复的报道较少见。Watelet等[9]发现，中性粒细胞炎症反应影响鼻窦炎术后的创伤愈合，与创伤后鼻窦黏膜修复过程中的纤维化呈负相关。本课题前期研究利用家兔制作鼻窦黏膜创伤修复的模型，发现再生的鼻窦黏膜中有大量的胶原沉积，在此过程伴有过度的炎症反应以及促炎因子-抑炎因子表达的失衡[10]。有学者[11]在中枢神经系统的研究中发现，IL-10可以抑制炎症因子肿瘤坏死因子α和IL-6的表达，而发挥抗炎作用。因此，在本研究中使用慢病毒作为表达载体，上调IL-10的表达，观察其对再生的鼻窦黏膜中胶原沉积及促炎、促纤维化因子表达的影响。

本研究中，与对照组及LV-GFP组相比，LV-IL-10治疗组再生的鼻窦黏膜中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的沉积以及白细胞的浸润明显减少，并伴有促炎因子IL-6、IL-8的表达降低，说明IL-10上调表达对减少鼻窦黏膜创伤修复后的瘢痕形成具有重要作用。其作用机制可能与IL-10下调促炎因子IL-6和IL-8的表达或抑制促纤维化因子的信号通路有关。在皮肤的创伤修复和腹部术后粘连形成的研究中，发现抑制IL-6的表达可以减少皮肤中的瘢痕形成及腹部粘连的形成[12-13]，说明IL-6是一种重要的促炎、促纤维化因子，抑制IL-6的表达可以减少炎症细胞浸润，并使相关的细胞因子表达减少，从而导致细胞的增殖、纤维细胞和角蛋白细胞的移动以及细胞外基质的沉积减少[12]。我们发现在鼻黏膜的创伤修复过程中，IL-6也有着相似的作用机制，在本研究中，LV-IL-10治疗后，再生组织中的IL-6表达及胶原沉积明显降低，且再生鼻黏膜中的白细胞浸润明显减少，与在皮肤创伤修复中的研究结果一致，进一步表明IL-6与鼻窦黏膜创伤修复后的瘢痕形成有关。

LV-IL-10治疗后再生鼻窦黏膜组织中IL-8的表达明显降低，提示IL-8可能与瘢痕形成有关。IL-8也是一种重要的促炎因子，它可以介导中性粒细胞的趋化，在慢性鼻窦炎的研究中发现IL-8与鼻窦炎的中性粒细胞浸润有关[14]。研究发现IL-8还与许多疾病的纤维化有关，如银屑病和肺纤维化等[15-17]。在这些疾病中，IL-8分泌导致的炎症级联反应在组织的纤维化过程起重要作用。在前期研究中，我们发现家兔上颌窦黏膜创伤后再生的黏膜中IL-8的表达水平明显升高，在本研究中，用IL-10治疗后，家兔再生的上颌窦黏膜中IL-8的表达和胶原沉积明显减少，且浸润的炎症细胞也减少，表明IL-8的表达与鼻窦黏膜创伤修复后的瘢痕形成有关。

TGF-β具有重要的抗炎效应，也是纤维化过程中的关键分子。TGF-β可以刺激组织金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的产生，该因子可以抑制细胞外基质的降解。Watelet等[18]研究了慢性鼻窦炎鼻息肉患者行鼻内镜手术后鼻腔分泌物中TGF-β1、TGF-β2的表达，发现与对照组比较，术后1周鼻腔分泌物中TGF-β1、TGF-β2的蛋白浓度明显升高，说明在慢性鼻窦炎鼻息肉术后，再生的鼻黏膜组织中TGF-β1、TGF-β2表达升高，可能与鼻窦炎术后再生黏膜的组织重塑有关。在肺纤维化研究中发现IL-10治疗可以降低TGF-β的表达，而降低肺纤维化的程度[19]。在本研究中，LV-IL-10治疗组与生理盐水组和LV-GFP组相比TGF-β的表达无明显改变，与肺纤维化的研究结果有所不同。其可能的原因为：①本研究中我们使用慢性细菌性鼻窦炎家兔制作创伤修复模型，炎性改变的上颌窦黏膜以水肿、增厚为主，创伤后再生的黏膜组织可能受周围水肿组织的影响，而影响了TGF-β的表达，因此，LV-IL-10治疗对TGF-β表达的调控不明显；②在肝纤维化的体外研究中发现，IL-10单独应用对肝星状细胞的胶原分泌无明显作用，而对TGF-β1诱导的肝星状细胞胶原的分泌具有明显抑制作用，其作用机制为IL-10通过抑制TGF-β1诱导的CTGF基因表达而发挥抗纤维化效应[20-21]，提示IL-10抗纤维化作用可能存在多种信号通路，其在鼻黏膜创伤修复中的抗纤维化作用是否与肺组织相似尚需进一步研究[22-23]。

目前上调IL-10的表达减少纤维化已经在多种疾病中有研究。IL-10在肺纤维化的进程中的作用尚不清楚，但有研究[19]表明，IL-10治疗可以减少肺纤维化。在大鼠慢性肾疾病模型中，给予IL-10治疗，可以降低肾纤维化和间质纤维化[24]。结合我们目前的研究，表明以慢病毒为载体使IL-10高表达可以抑制再生鼻窦黏膜中的炎症反应和下调促炎因子的表达，减少胶原沉积，降低纤维化以上动物实验表明，IL-10高表达可以为鼻黏膜的创伤修复提供有利的细胞因子局部微环境。其机制是通过下调促炎因子的表达，减少炎症细胞的浸润，或抑制促纤维化信号通路而使再生的鼻黏膜中胶原沉积下降，改善再生黏膜的组织重塑。本研究为IL-10在鼻黏膜创伤修复中的应用提供了理论依据，为减少鼻窦炎术后的瘢痕形成和局部粘连提供了新的思路。

参 考 文 献

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(本文编辑杨美琴)

Effect of interleukin 10 overexpression on the wound healing in a rabbit model of chronic bacterial sinusitis

SUNXi-cai,LIHan,WANGHuan,WANGJing-jing,HULi,SONGXiao-le,YUHua-peng,MANa,WANGDe-hui.

DepartmentofOtorhinolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,ChinaCorresponding author： WANG De-hui， Email： wangdehuient@sina.com

【Key words】Chronic sinusitis; Wound healing; Interleukin 10; Lentiviral vector; Rabbit

【Abstract】ObjectiveTo observe the role of interleukin 10(IL-10)) overexpression on the wound healing in a rabbit model of chronic bacterial sinusitis. MethodsA rabbit wound-healing model was established in the maxillary sinus with chronic bacterial sinusitis. A lentiviral vector (LV) expressing IL-10 and green fluorescent protein (GFP) (LV-IL-10) or GFP alone (LV-GFP) was injected at the wound site 3 days before. Physiological saline was injected at the wound site 3 days before as normal control. At 3 and 10 days post wounded, the sizes of maxillary ostia were recorded, and histological changes in the sinus mucosa were examined by means of hematoxylin and eosin(HE) and Masson trichrome staining at 10 days post wounded. Real time polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to measure the gene expression of IL-6, IL-10, TGF-β, and collagen types I and III.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the concentrations of IL-6, IL-8, IL-10, and collagen types I and III. ResultsBoth LV-IL-10 and LV-GFP were expressed in the wounds at 3 and 10 days post wounded. At 3 and 10 days, when compared with LV-GFP and physiological saline injection, LV-IL-10-treated wounds demonstrated decreased inflammation, collagen deposition and decreased quantities of proinflammatory mediators analyzed with statistically different levels of IL-6 and IL-8. However, there was no significant difference in the expression of transforming growth factor β (TGF-β) among the three groups. ConclusionsLocal application of lentvirus-mediated overexpression of IL-10 decreases the inflammatory response and collagen deposition in a rabbit wound-healing model of maxillary chronic sinusitis.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:10-15)

通讯作者：王德辉(Email： wangdehuient@sina.com)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.01.004

(收稿日期2015-05-08)

△基金项目：上海市卫生局青年基金(20124y047)