特发性肺纤维化中TGF-β1诱导上皮细胞间质转化作用机制研究进展

邱　静　孙　建　李万成



·综述·

特发性肺纤维化中TGF-β1诱导上皮细胞间质转化作用机制研究进展

邱静1孙建2李万成2

肺纤维化，特发性；TGF-β1；上皮细胞间质；转化

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种慢性、进行性、纤维化间质性肺炎，为临床最常见的一种特发性间质性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia, IIP)，其特征性病理改变类型为普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia, UIP)[1-2]。IPF病理特点为Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，肌纤维母细胞聚集以及肺实质结构重塑[3]。目前认为IPF起源与肺泡上皮反复发生微小损伤后的异常修复有关。反复的微小损伤导致肺泡上皮异常激活，产生多种生长因子和趋化因子诱导纤维形成及间质细胞增殖[4-5]。IPF中成纤维细胞和肌纤维母细胞主要通过EMT过程产生。EMT是指完全分化上皮细胞通过细胞表型改变转化为完全分化间质细胞的过程，主要转化为成纤维细胞和肌纤维母细胞[6]。近年研究发现TGF-β1通过促进细胞外基质的沉积、促进成纤维细胞的增殖和转化、诱导 EMT的发生以及协同其他细胞因子如血小板源生长因子、结缔组织生长因子等参与肺纤维化的形成[7-8]。现对其在IPF中诱导EMT过程作用机制研究进展作一综述。

一、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)

EMT是指完全分化上皮细胞通过特定程序导致细胞表型改变转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过EMT过程上皮细胞失去极性，标志物丢失或下调，细胞骨架重建，获得成纤维细胞形态，具有可移动性和侵袭性。EMT分为3型：1型EMT与胚胎植入、发育和器官形成相关，也能通过EMT逆转产生新的上皮；2型EMT与损伤修复、组织再生和器官纤维化相关，在创伤和炎症损伤后产生成纤维细胞和其他相关细胞重构组织；3型EMT出现于新生的细胞，与肿瘤形成和转移有关，由癌基因通路介导[9]。

EMT发生时上皮细胞标志物表达缺失或下调，间质细胞标志物表达上调[10]。上皮细胞标志物主要有：E-钙粘素(E-cadherin, E-cad)，紧密连接蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)。间质细胞标志物主要有：α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SM A )、波形蛋白(vimentin)、Ⅰ型胶原蛋白(col type I)、纤维连接蛋白(fibronectin)、纤维状肌动蛋白(F-actin)[11]。

上皮细胞通过细胞间黏附机制相互连接，E-cad为上皮细胞间紧密连接的重要成分，可保持细胞完整性和极性。EMT早期E-cad表达受限，导致细胞间紧密连接受损，上皮细胞黏附性减弱，迁徙性增强。细胞骨架重排，新表型蛋白α-SMA、vimentin等表达，细胞形态发生改变，类似成纤维细胞或肌纤维母细胞。这些改变导致细胞迁徙、收缩能力增强[12]。

二、转化生长因子β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)

TGF-β1是一种多功能细胞因子，在细胞生长、分化、免疫调节、细胞外基质( extracellular matrix, ECM )合成及损伤修复方面起着重要作用[13]。可由血小板、上皮细胞、间质细胞、巨噬细胞等产生，肺内的 TGF-β1 主要由肺上皮细胞、巨噬细胞分泌。哺乳动物中TGF-β家族含有3个亚型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们通过与相应受体结合发挥作用。目前发现与TGF-β具有特异性结合的受体有3类：即 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、TGF-βRⅢ[14]。Ⅰ、Ⅱ型受体为跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，细胞对TGF-β剌激的应答主要依赖于Ⅰ、Ⅱ型受体间的相互作用。TGF-β与TGF-βRⅠ、Ⅱ结合形成聚体复合物，TGF-βRⅡ连接TGF-βRⅠ与TGF-β，TGF-βRⅠ负责传递TGF-β信息[15]。

TGF-β1由Assoian等1985年首次在人血小板中分离出来。活化的TGF-β1相对分子量为25×103的多肽，由2条相对分子量为11×103，含有112个氨基酸构成的单链通过二硫键结合而成[16]。其主要作用为：促进成纤维细胞和肌成纤维细胞合成胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，趋化并促进成纤维细胞分裂增殖及成熟分化，抗炎和促进损伤修复[17]。

三、TGF-β1与EMT

TGF-β1被证实是肺纤维化的关键细胞因子。用TGF-β1处理肺上皮细胞后发现上皮细胞标志物E-cad等表达下调，间质细胞标志物α-SMA等表达上调。而细胞形态也发生改变，上皮细胞间连接减少，细胞成纺锤体样[18]，上皮细胞发生EMT。证明TGF-β1可诱导EMT，在肺纤维化中起重要作用[19]。其诱导EMT信号传导通路主要有Smad蛋白依赖型和非Smad蛋白依赖型。

1. Smad蛋白依赖型信号传导通路: Smad蛋白是近年发现参与TGF-β信号细胞内传导的一类信号蛋白[20]。哺乳动物中有8种Smad蛋白，根据结构和功能分为3类：①受体调节型Smad蛋白(R-Smads)，包括Smad1、2、3、5、8；②共同中介型Smad蛋白(Co-Smads),包括Smad4；③受体抑制性Smad蛋白(I-Smads)，包括Smad6、7[21]。

TGF-β1信号由Smad蛋白从细胞浆传到细胞核，与其他转录因子共同调节靶基因转录[22]。信号传导中，TGF-β1首先与TGF-βRⅡ结合形成二聚体复合物，然后与TGF-βRⅠ结合形成四聚体复合物，从而激活TGF-βRⅠ。TGF-βRⅠ与Smad2、3蛋白结合使其磷酸化，导致其活化。活化的Smad2、3蛋白与Smad4蛋白结合成为复合物转移至细胞核中参与靶基因调节。Smad6、7蛋白可与TGF-βRⅠ结合，抑制Smad2、3蛋白活化，从而阻止TGF-β1信号传导[23-25]。高洁等[26]通过给Smad3基因敲除大鼠注射活性TGF-β1，证明其可阻碍TGF-β1诱导组织蛋白酶抑制剂(TMP-1)表达，从而促进肺纤维化的发生。徐国萍等[27]实验证明TGF-β1可在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生间质转化，其机制与Smad信号传导通路有关。

2. 非Smad蛋白依赖型传导通路

非Smad蛋白依赖型传导通路主要包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路、Rho/ROCK通路、Wnt/Wingless信号通路、过氧化物酶体增生物激活受体( peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)等。

(1)MAPK通路: MAPK通路是非Smad蛋白依赖型通路中最重要的一条途径。其信号传导途径由丝/苏氨酸蛋白激酶组成，通过MAPKKK-MAPKK-MAPK级联反应逐级磷酸化，将信号从细胞外传导至细胞内、细胞核中，从而调控基因表达及细胞周期。 MAPK包括：细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)、应激活化蛋白激酶(SAPK/JNK)、p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinasep, p38MAPK)、ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶 1 (big MAP kinase1, BMK1) ，其中p38MAPK与肺纤维化关系密切[21-22]。

MAPK诱导EMT过程机制可能有：①TGF-β激活TGF-β受体复合物时，导致p38MAPK逐级活化，诱导转录因ATF-2和ELK-1调节靶基因转录，从而调控EMT蛋白表达；②TNF受体结合蛋白6与TGF-β联合激酶1(TAK1)通过TGF-βRⅠ泛素化激活，Smad7蛋白连接TGF-βRⅠ与p38MAPK、TAK1、JNK并激活因子，调节转录因子c-Jun和c-Fos，从而调控EMT[24]。

(2)Rho/ROCK通路： Rho蛋白是Ras超家族中最早克隆出来的蛋白，具有GTP酶活性，被称为Rho GTP酶。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，为Rho下游效应分子[24]。Rho调控细胞骨架蛋白，细胞黏附及能动性、促进应力纤维形成。Rho通过多种细胞因子调控，激活剂为：鸟苷酸交换蛋白(GEF)；抑制剂为：GTP酶激活蛋白、GDP解离抑制因子( GDP dissociation inhibitor, GDI)。

正常情况下Rho与GDI结合成无活性复合物,当受到细胞外信号刺激时，GEF催化Rho活化，Rho从复合物中解离，转移至细胞膜，将信号传递给ROCK，其丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活，活化ROCK诱导肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失去活性，解除对MLC脱磷酸化作用，使胞浆中MLC磷酸化水平上调。MLC磷酸化水平在平滑肌细胞中决定细胞收缩功能，在非平滑肌细胞中控制肌动蛋白微丝骨架聚合动力学。Rho/ROCK通路通过调节微丝骨架参与EMT过程[29]。刘小贤[30]的研究证明Rho/ROCK通路参与了TGF-β1介导的上皮细胞EMT过程。

(3) Wnt/Wingless信号通路： Wnt/Wingless与多种生长因子共同作用参与EMT过程，其中包括TGF-β1。Wnt蛋白本身不能诱导EMT，主要通过β-catenin调节。其可抑制Wnt蛋白重要成分GSK-3，导致细胞中β-catenin大量积聚，上皮细胞E-cad表达下调，从而调控EMT过程[31-32]。

(4) 过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)：PPAR是近年发现的一种G蛋白偶联受体，研究发现PPAR可使A549细胞、肺泡上皮细胞发生EMT过程。Sun等[32]实验证明PPAR-γ可使上皮细胞E-cad表达下调，减少结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原的生成。PPAR调节EMT的具体机制目前仍不明确，有待进一步研究。

(5)核转录因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)： NF-κB是一种多功能的核转录因子,为调控免疫反应和炎症的主要核转录因子之一。核转录因子包括Snail家族、HLH家族、ZEB家族[33-34]。Snail为锌指转录因子，由Snail1、Snail2、Snail3组成；ZEB主要包括ZEB-1与ZEB-2[35]。研究表明，NF-κB可促进转录因子Snail、ZEB-1和ZEB-2的表达从而使上皮桥粒斑蛋白和E-cadherin基因的表达下调,同时诱导Vimentin间质特定基因的表达上调,从而诱导EMT的发生[36]。

IPF为不可逆疾病，呈进行性发展，最终可导致呼吸衰竭，是呼吸系统严重慢性疾病之一。其发病机制尚不明确，目前缺乏有效的治疗手段及治疗药物。TGF-β1诱导的上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在IPF中其着重要作用，EMT分子机制及抑制机制还未完全清楚，加强对上述作用机制及其他未发现新的作用机制深入研究可为临床治疗提供新的药物作用靶点及新的治疗手段。

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(本文编辑：张大春)

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10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.026

四川省科技厅基金资助项目(2014JY0176)

610500 成都医学院基础医学院1

610500 成都医学院第一附属医院呼吸内科2

李万成，Email: 316608439@qq.com

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2015-6-10)