清热抗毒煎剂对普通型手足口病患儿外周血Treg、Th17平衡的调节作用*

清热抗毒煎剂对普通型手足口病患儿外周血Treg、Th17平衡的调节作用*

河北省石家庄市第五医院

阎纳新许尊贵杨莉李博柳晓金刘洪德郑浩杰(石家庄 050021)

提要目的：研究清热抗毒煎剂对普通型手足口病患儿外周血中Th17与调节性T细胞(Treg细胞)及相关细胞因子的水平的影响。 方法：采用流式细胞术检测30例正常儿童及15名普通型手足口患儿外周血中(CD3+CD8-IL-17+)Th17及(CD4+CD25+Foxp3+)Treg细胞表达量，采用ELISA方法检测血清中IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β1的水平。结果：普通型手足口患儿治疗前与正常对照组相比，Treg细胞表达量、Treg/Th17比率及TGF-β1水平均明显降低，Th17细胞表达量明显升高(P值均<0.05)，IL-17、IL-6及IL-23有增高趋势，IL-10有降低趋势，但差异无显著性(P>0.05)；治疗后患儿体内Treg/Th17比率及TGF-β1水平与治疗前相比均明显升高，Th17细胞表达量明显降低(P值均<0.05)，与正常对照组相比差异无显著性( P>0.05)，IL-17、IL-6及IL-23有降低趋势，IL-10有增高趋势，但差异无显著性(P>0.05)。结论：清热抗毒煎剂可能通过抑制Th17细胞及其相关的细胞因子的产生，调整普通型手足口患儿体内Treg/Th17平衡紊乱，抑制体内炎症的进展，这是其治疗普通型手足口病机制之一。

关键词手足口病；清热抗毒煎剂；传染病；肠道病毒；Treg细胞；Th17细胞；细胞因子

中图分类号：R285.6

文献标识码：码：A

文章编号：号：1007-5615(2015)03-0040-04

通讯作者：郑浩杰，男，副主任医师，硕士。

手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。HFMD的临床表现轻重不一，轻者仅表现为自限性手足口病或疱疹性咽峡炎，为HFMD的普通型。近年研究显示HFMD患者体内存在细胞免疫功能紊乱，[1]我们前期的研究证实CD4+T细胞的两个新亚型辅助性T细胞17( Th17) 及调节性T细胞(Treg)所形成的Treg/Th17平衡失调在手足口病发病中发挥重要作用。[2]清热抗毒煎剂为石家庄市第五医院经验方，具有清热解毒泻火，凉血祛湿的作用，临床实践表明对普通型手足口病治疗效果显著。本文对HFMD普通型患儿经清热抗毒煎剂治疗前后Treg细胞及Th17细胞的数量及其相关细胞因子的动态变化趋势进行研究，探讨清热抗毒煎剂治疗普通型手足口病的作用机制。

1材料与方法

1.1研究对象选择2013年7月至2013年10月于石家庄市第五医院住院治疗的HFMD患儿15例，诊断标准均符合中华人民共和国卫生部颁发的《手足口病诊治指南(2010年版)》[3]普通型诊断标准，男8例，女7例，平均年龄1.96±0.67岁，表现为手、足、口、臀部出现皮疹，伴或不伴发热，所选患儿经治疗均痊愈出院，同时排除合并其他病毒与细菌感染，且入院前未接受任何治疗。另外选择同年龄健康儿童30例，作为正常对照组，其中男17例，女13例，平均1.52±0.73岁，2组儿童年龄之间差异无显著性(P=0.097)，具有可比性。

*河北省中医药管理局资助项目：No 2011055

1.2试剂所用流式抗体均购自Biolegend公司，FOXP3 FIX/Prem Buffer Set、FOXP3&PERM Kit(破膜剂)、离子霉素、莫能菌素及佛波酯均购自Liankebio公司，所有检测细胞因子的ELISA试剂盒均购自R&D公司，淋巴细胞分离液购自天津灏洋公司，RPMI1640培养基购自GIBIC公司。

1.3治疗方法普通型手足口患儿均给予基础治疗，包括给予水溶及脂溶性维生素及给予磷酸肌酸钠针营养心肌治疗，在此基础上同时给予清热抗毒煎剂口服治疗，每次5 mL，每日3次(由石家庄市第五医院制剂室提供)。清热抗毒煎剂组成：生石膏、板蓝根、升麻、藿香、蒲公英、黄连、白茅根。疗程7 d。

1.4标本的采集于HFMD患儿入院第1天及治疗第7天时，无菌采集肝素抗凝血2 mL，用于外周血Treg细胞及Th17细胞含量的检测，同时采外周静脉血1 mL，离心分离血清，-80℃冷冻保存，用于检测细胞因子的含量，所有健康儿童同样方式采集及保存标本。

1.5外周血Treg细胞表达量的检测取100 μL抗凝全血加至流式管中，分别加入抗体CD4-PE、CD25-PC5各5 μL，混匀，室温避光孵育15 min加入PBS 1 mL，1 500 rpm 离心5 min，弃上清；加入A液(破膜剂A)100 μL，室温避光孵育 15 min，1 500 rpm 离心5 min，弃上清；加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3 mL，1 500 rpm离心5 min；加入B液(破膜剂B)100 μL及Foxp3 mAb-FITC10 ~20 μL，混匀，室温孵育20 min，加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3 mL，1 500 rpm 离心5 min，弃上清；加入PBS 500 μL重悬细胞，上流式细胞仪检测(CD4+CD25+Foxp3+)Treg细胞表达量。

1.6外周血Th17细胞表达量的检测取抗凝全血2 mL，Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，用RPMI1640培养液调整PBMC密度为2×106个/mL， 将2 mL细胞悬液加入6孔板，同时加入佛波酯 100 ng/mL及离子霉素1 μg/mL进行刺激，置于37℃、5% CO2培养箱孵育1 h，加莫能菌素1 μg/mL，继续培养6 h，将培养的细胞2 000 rpm离心5 min，弃上清；加入1 mL PBS洗涤弃上清；再分别加入CD3-PC5、CD8-FITC抗体各5 μL，室温避光孵育30 min；再次应用1 mL PBS洗涤，弃上清后加入Th17破膜剂A液100 μL，室温避光15 min；再次应用1 mL PBS洗涤弃上清；加入B液100 μL并立即加入10 μL标记的鼠抗人IL-17-PE抗体，室温避光孵育30 min；再次应用1 mL PBS洗涤弃上清，重复洗涤1次后，500 μL PBS重悬细胞，震荡混匀，转移至流式细胞仪专用管内，避光上流式细胞仪检测(CD3+CD8-IL-17)Th17细胞表达量。

1.7外周血中细胞因子的检测采用ELISA方法检测普通型HFMD患儿及健康儿童血清中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素23(IL-23)、人转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.8统计学方法所有资料处理均用SPSSl3.0软件包进行分析，检测结果以±s表示，采用t检验比较各组间的差异，多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)， P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1Treg细胞表达量的检测普通型HFMD患儿在治疗前、治疗后的Treg细胞表达量与正常对照组相比均明显降低，差异具有显著性(P=0.001；0.006)，治疗后与治疗前相比有一定程度的升高，但是差异无显著性(P=0.253)。结果见表1、图1。

2.2Th17细胞表达量的检测普通型HFMD患儿在治疗前体内的Th17细胞表达量与正常对照组相比明显升高，差异具有显著性(P=0.016)，治疗后体内的Th17细胞表达量与治疗前相比明显降低，差异具有显著性(P=0.008)，与正常对照组相比差异不显著(P=0.476)。结果见表1、图2。

2.3各组Treg/Th17比值的比较普通型HFMD患儿治疗前外周血中Treg/Th17比值与正常对照组相比明显降低，差异具有非常显著性(P=0.001)，而治疗后Treg/Th17比值与治疗前相比明显升高，差异具有显著性(P=0.010)，与正常对照组相比差异无显著性(P=0.333)。结果详见表1。

表1　各组Treg细胞及Th17细胞表达量　()±s)

表1　各组Treg细胞及Th17细胞表达量　()±s)

组别时间例数Treg细胞(%)Th17细胞(%)Treg/Th17正常对照组306.55±3.78 0.27±0.22 32.78±20.79 普通型HFMD组治疗前152.41±2.17▲0.47±0.41▲7.07±6.77▲治疗后153.74±2.39▲0.21±0.14★26.60±26.14★F9.8424.3918.359P0.0010.0170.001

注：与治疗前相比 ， ★P<0.05； 与正常对照组相比，▲P<0.05

图1(CD4+CD25+Foxp3+)Treg细胞流式细胞术检测示意图

图2(CD3+CD8-IL-17+)Th17细胞流式细胞术检测示意图

2.4各组血清细胞因子含量的比较普通型HFMD患儿血清IL-6、IL-17及IL-23治疗前的含量与正常对照组相比差异不大，IL-6、IL-17有一定程度增高，而治疗后这3种细胞因子含量则低于正常对照组，但是差异不显著(F=0.319、1.759、1.688，P=0.728、0.181、0.194)；普通型HFMD患儿血清IL-10的含量在治疗前、治疗后与正常对照组相比均有一定程度的降低，治疗后比治疗前有一定升高，只是3组之间差异不显著(F=1.526，P=0.226)；普通型HFMD患儿血清TGF-β1的含量治疗前与正常对照组相比明显降低，差异具有显著性(P=0.001)，而治疗后与治疗前相比明显升高，差异具有显著性(P=0.006)，与正常对照组相比则差异不显著(P=0.556)。结果详见表2。

表2各组血清细胞因子的含量

(pg/mL)

注：与治疗前组相比，★P<0.05； 与正常对照组相比， ▲P<0.05

3讨论

HFMD是小儿常见的由肠道病毒引起的急性传染病，具有传染性强、传播途径广、病情发展迅速等特点，临床以手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹及发热为主要表现。根据病情分为普通型和重症，其中绝大部分病例为普通型，少数病例为重症，目前手足口病没有特殊的治疗方法，多采用对症治疗。[4]我院根据本病形成的病因病机特点，研制出清热抗毒煎剂中药方剂，临床实践表明清热抗毒煎剂治疗手足口病普通型安全有效，有明显的退热、促进疱疹和(或)皮疹消退、减轻症状、缩短病程等综合疗效。目前人们已注意到HFMD患儿体内存在细胞免疫功能紊乱，[1-2，5]而中药对免疫系统的调节作用成为近年研究的热点。既往人们已经认识到Th1/Th2平衡维持肌体的免疫功能稳定的重要性，近年来发现Treg/Th17平衡在肌体免疫中也发挥着重要作用，是对Th1和Th2免疫平衡理论的重要补充。Treg和Th17在肌体中的作用是相反的，Treg是CD4+T淋巴细胞，为一类具有免疫抑制作用的T细胞，在调节免疫反应过程中发挥着关键作用，Thl7细胞在自身免疫性疾病和炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用，以高分泌IL-17为特征，具有强大的促炎效应。[2]在本研究中可见普通型HFMD患儿体内Treg细胞明显减少，Th17细胞明显增多，Treg/Th17比值明显降低，显示患儿体内存在Treg/Th17平衡紊乱，这与我们以前的研究结果基本一致，[2]而患儿经清热抗毒煎剂治疗后，Treg细胞有一定程度的增高，但与治疗前比差异不显著，Th17细胞则明显减低，因此致使Treg/Th17比值明显回升，与治疗前相比差异显著，与正常对照组相比差异无显著性，提示清热抗毒煎剂主要抑制Th17细胞的生成，调节Treg细胞和Th17细胞之间的平衡，使Treg/Th17平衡紊乱得到恢复。

Treg 与 Th17 由同一种前体细胞分化而来，它们的分化途径具有互逆性，未分化的Th细胞在不同细胞因子的作用下向着不同的方向分化，Th17与Treg之间的关系与 TGF-β 密切相关，研究表明，低浓度的 TGF-β与 IL-6 协同作用可促进Th17 的生成，而高浓度的 TGF-β 则能促进Foxp3 的表达，促进 CD4+T 细胞向 Treg 方向分化。[6]在本研究结果可以看出治疗前IL-6与正常对照组相比有所增高，而TGF-β1与正常对照组相比明显降低，且差异有显著性，而治疗后TGF-β1明显升高，与正常对照组比差异不大，而IL-6则呈降低趋势，甚至低于正常对照组，可见治疗前患儿体内细胞因子的浓度是趋向促进向Th17细胞分化，经清热抗毒煎剂治疗后，患儿体内的细胞因子作用是促进向Treg的分化，而抑制Th17的生成，由此可见清热抗毒煎剂具有调节Treg 与 Th17的分化的功能。

Treg细胞和Th17细胞的功能发挥通过肌体多种细胞因子进行调节。Treg 通过分泌 IL-4、IL-10 和TGF-β，参与自身免疫性疾病、移植免疫、肿瘤免疫等。[7]IL-10和TGF-β1为抗炎性细胞因子，本研究中显示患儿体内IL-10、TGF-β1的含量在治疗前与正常对照组相比降低，治疗后比治疗前增高，只是IL-10的含量差异不显著，TGF-β1的含量则是差异具有显著性，由此可见清热抗毒煎剂通过促进这两种细胞因子的产生而增强Treg细胞对炎症反应的抑制作用。Thl7作为一种炎性细胞，主要通过分泌IL-17等促炎因子参与炎性疾病的发生发展。[8]IL-6、IL-17为促炎因子，IL-17 与IL-6 共同促进骨髓内中性粒细胞的分化及向炎症部位募集，激发炎症反应。[9]从本研究可以看出在治疗前患儿血清内IL-17、IL-6均比正常对照组增多，治疗后则含量下降，甚至比正常对照组还低，虽然差异不显著，但是这两种细胞因子还是呈降低趋势。IL-23具有维持和扩大Th17的功能，促进IL-17的产生，[10]本研究结果亦显示患儿治疗后血清内IL-23的含量与治疗前相比有所降低，虽然差异不显著，但是呈降低趋势，可见清热抗毒煎剂通过抑制IL-17、IL-6、IL-23与Th17相关细胞因子的产生，进一步抑制Th17细胞的功能。

总之，从本研究结果显示清热抗毒煎剂可能通过抑制Th17细胞及其相关的细胞因子的产生，调整普通型手足口患儿体内Treg/Th17平衡紊乱，抑制体内炎症的进展，这可能是其治疗普通型手足口病的机制之一。本研究收集HFMD患儿病例较少，还需增大样本进一步验证清热抗毒煎剂的作用机制。

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(2015-05-03收稿)