固相萃取--气相色谱法测定茶叶中的角鲨烯

袁新跃 陈瑜 张培洪 胡路平 周阳元 袁燕村

（浙江省杭州市富阳区食品安全检验检测中心，311400）

角鲨烯最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene，其化学名称为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜，也称鲨烯。角鲨烯具有抗氧化、抗辐射、抗疲劳和增强人体免疫的作用，可用于肝病治疗，并具有一定的抗癌、防癌及保温养颜作用。角鲨烯最早发现于深海鲨鱼肝脏中，后研究人员从植物中提取得到不同含量的角鲨烯，近年来研究人员发现糯米香茶中含有丰富的生物活性物质角鲨烯，使得糯米香茶成为提取角鲨烯的潜在植物资源，有待进一步开发利用。此外，郑德勇等研究了角鲨烯在茶籽中生长成熟过程中含量的变化规律。大量的研究发现，茶叶籽中含有丰富的角鲨烯。本文建立一种固相萃取-气相色谱法来准确测定茶叶中角鲨烯含量的方法，为进一步研究茶叶中角鲨烯工作奠定了基础。

一、材料与方法

1.仪器与试剂

气相色谱仪（Agilent 7890A，美国），配火焰离子化检测器（FID）；HP-5毛细管色谱柱（30 m×0.25mm×0.25μm），旋转蒸发仪（IKA RV10）；氮吹仪；超声波（2kw）。

正己烷（色谱纯，默克公司）；乙腈（色谱纯，默克公司）；石油醚（分析纯，30～60℃沸程）等。

2.标准溶液的配制

（1）标准储备液的配制

准确称取100.0mg角鲨烯标准品于100mL容量瓶内，加适量正己烷，振摇，使角鲨烯完全溶解后，再加正己烷，定容至刻度，摇匀，即配成1000μg/mL储备液。

（2）标准工作液的配制

分别吸取 1000μg/mL 储备液 1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL、10.0mL于100mL的容量瓶中，加正己烷定容至刻度，得到浓度分别为 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的标准工作液。

3.仪器条件

进样口温度：300℃；

检测器温度：330℃；

进样体积：1μL;

升温程序：160℃（保持2min），15℃/min升到280℃（保持5min），然后5℃/min升到300℃（保持2min）;

分流方式：不分流;

柱流速：2.5mL/min（恒流模式）;

尾吹气：30mL/min;

载气:高纯氮气(99.99%)。

4.样品制备

称取茶叶样品10.00g，加入50mL石油醚浸泡，超声提取1h，过滤，滤渣用10mL石油醚淋洗2次，合并滤液，于35℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干，加入5mL正己烷溶解，过经10mL乙腈甲苯溶液（乙腈∶甲苯=3∶1）活化，5mL正己烷平衡的Cleanert TPT小柱，再用10mL正己烷洗脱小柱，收集洗脱液，氮吹浓缩至近干，加入5mL正己烷溶解，过0.45μm膜，待上机检测。

二、结果与分析

1.标准曲线及检出限

以1000μg/mL的标准储备液，分别配制成浓度为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100 μg/mL的标准溶液，进样体积为1μL。以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，得到线性方程:y=23.5414x+3.2128，线性相关性R2=0.9999。取3倍信噪比（S/N=3）时，角鲨烯的检出限为1mg/kg。

2.方法回收率

取茶叶样品为对照（CK），分别添加浓度为10.0mg/kg、20.0mg/kg、50.0mg/kg的角鲨烯，按前述方法进行样品前处理，测定不同添标浓度和对照茶样中的角鲨烯浓度，每个添标浓度和参照茶样均做3份平行，所得添标回收率及相对标准偏差见表1。

表1 回收率实验结果

表2 精密度实验结果

表3 不同茶叶样品中角鲨烯含量mg/kg

3.方法精密度

取茶样样品，按前述方法进行样品前处理，做6份平行，所测浓度及相对标准偏差见表2。由表2可以看出，茶叶中角鲨烯测定结果的相对标准偏差为1.5%，说明方法具有良好的重复性。

4.样品分析

应用所建立的分析测定方法，对3种不同种类的茶叶样品进行了分析，所得检测结果见表3。图2为乌龙茶茶样中角鲨烯色谱图。

三、讨论

实验结果表明：固相萃取-气相色谱法测定茶叶中角鲨烯含量的方法，重现性好，目标峰分离效果好，通过Cleanert TPT小柱脱色处理后，可以有效的去除干扰峰。方法在10～50 mg/kg的添标水平，方法回收率在94.0%～100.6%，最低检出限达到1mg/kg，可以满足茶叶中角鲨烯含量测定的要求。实验还对绿茶、红茶和乌龙茶中的角鲨烯含量进行了检测，发现在绿茶、红茶和乌龙茶中均有检出角鲨烯，且乌龙茶中角鲨烯含量达到233.8mg/kg，这对进一步开发茶叶应用价值，提高资源利用率有一定的意义。关于茶叶中角鲨烯含量测定国内外还没有文献报道，因此本方法的建立将对以后茶叶中角鲨烯的研究提供一定的指导意义。

图1 角鲨烯标样色谱图（50μg/mL）

图2 乌龙茶茶样中角鲨烯色谱图