重症肺炎机械通气患者痰MMP-9与TIMP-1水平变化及对病情判断的评价

重症肺炎机械通气患者痰MMP-9与TIMP-1水平变化及对病情判断的评价

江颖仪曾勉李德宪

【摘要】目的探讨痰上清液基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织型抑制剂-1(TIMP-1)水平对重症社区获得性肺炎(sCAP)患者病情判断的参考价值。方法收集31例sCAP患者及27例普通CAP患者入院或入ICU当日的血及诱导痰标本。24例存活的sCAP病例作为连续观察组，按是否需要机械通气分为机械通气治疗组(V组)11例、非机械通气治疗组(NV组)13例，于第4、8日及出院或转科当日收集诱导痰标本。另收集20名健康志愿者作为对照组，均在纳入当日抽血及进行痰液诱导。检测受试者血中白细胞、CRP、PaO2、痰MMP-9及TIMP-1水平。结果与对照组相比，V组及NV组入院时痰MMP-9、TIMP-1水平明显升高(P均<0.01)，治疗期间，V组及NV组痰MMP-9、TIMP-1水平均不同程度下降， V组患者痰MMP-9、TIMP水平下降不明显，至出院或转科当日仍高于对照组(P均<0.01)，NV组患者痰MMP-9、TIMP-1水平至出院或转科当日与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。相关性分析显示，24例sCAP患者的痰MMP-9、TIMP-1水平与APACHEⅡ评分、白细胞呈正相关(P均<0.01)，与PaO2、PaO2/吸入氧浓度呈负相关(P均<0.01)，痰MMP-9水平与TIMP-1水平呈正相关(r=0.599，P<0.01)。ROC分析显示，痰MMP-9及TIMP-1水平对诊断sCAP的曲线下面积分别为0.876及0.793(P均<0.01)，最佳临界值分别为909.61、1 076.80 μg/L。结论痰MMP-9与TIMP-1水平测定对sCAP的识别、判断具有一定的临床价值，机械通气治疗的sCAP患者痰MMP-9及TIMP-1水平下降较缓慢，提示机械通气有加重肺部炎症反应的可能。

【关键词】重症肺炎；基质金属蛋白酶-9；组织型抑制剂-1；机械通气

收稿日期：(2015-04-26)

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.10.008

通讯作者，周昭远

Changes of metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 levels in sputum of patients with severe community-acquired pneumonia and evaluation on the severity of lung inflammationJiangYingyi，ZengMian,LiDexian.DepartmentofMedicalIntensiveCareUnit,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

Correspondingauthor，ZengMian,E-mail:zengmian2004@163.com

Abstract【】ObjectiveTo evaluate the clinical significance of the levels of metalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in the sputum supernatants in evaluating the severity of severe community-acquired pneumonia (sCAP). MethodsThirty one patients with sCAP ard twenty seven patients with common CAP were enrolled. Their blood and induced sputum samples were obtained on the day of admission or intensive care unit (ICU). Twenty four survived patients in the sCAP group were subject to dynamic observation and divided into the mechanical (group V; n=11) and non-mechanical ventilation subgroups (group NV; n=13). Induced sputum samples were collected on days 4, 8 and the day of discharge. Another 20 healthy volunteers served as the control group. Blood and sputum samples were obtained on the day of participation in this study. White blood cell (WBC) count, CRP and PaO2 levels in the blood and MMP-9 and TIMP-1 levels in the sputum were detected. ResultsCompared with control group, MMP-9 and TIMP-1 levels on the day of admission in the subgroups V and NV were dramatically decreased (both P<0.01). During the treatment, MMP-9 and TIMP-1 levels in the subgroups V and NV tended to decline. The sputum levels of MMP-9 and TIMP-1 did not significantly decrease in the subgroup V, significantly higher compared with the levels in the control group on the day of discharge or transfer (both P<0.01). The sputum levels of MMP-9 and TIMP-1 did not significantly differ between the NV and control groups on the day of discharge or transfer (both P>0.05). Correlation analysis revealed that the sputum levels of MMP-9 and TIMP-1 were positively correlated with the APACHEⅡscore and blood WBC count (both P<0.01) and negatively associated with PaO2 level and PaO2/FiO2 ratio (both P<0.01). The sputum level of MMP-9 was positively correlated with TIMP-1 level (r=0.599, P<0.01). ROC analysis showed that the areas under the curve of the sputum levels of MMP-9 and TIMP-1 levels in the diagnosis of sCAP were 0.876 and 0.793 (both P <0.01), with optimal cut-off values of 909.61 μg/L and 1 076.80 μg/L. ConclusionsMeasurement of MMP-9 and TIMP-1 levels in the sputum is of certain clinical significance in identifying sCAP. The MMP-9 and TIMP-1 levels in the sputum of patients with mechanical ventilation tended to decline slower than those without mechanical ventilation, prompting that mechanical ventilation probably exaggerate lung inflammation.

【Key words】Severe pneumonia; Matrix metalloproteinase-9;

Tissue inhibitor of metalloprotenase-1; Mechanical ventilation

肺炎是由细菌、病毒或其他病原体引发的肺部炎症，有较高的发病率和病死率，重症肺炎是肺炎死亡的重要原因之一。有报道，住院的社区获得性肺炎(CAP)患者中重症CAP(sCAP)的发病率为6.3%，病死率为45.0%[1]。随着人口老年化进程的加快，肺炎发病率亦随之增高，这就要求临床医师在临床实践中要十分警惕[2]。早期发现并作相应处理是sCAP救治的关键。但是，目前临床上缺乏可靠的诊断及评估肺炎严重程度的早期预测因子。国外有文献报道，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织型抑制因子-1(TIMP-1)在sCAP的进程中发挥了一定作用。在正常情况下，肺组织仅表达少量的MMP-9，但在各种刺激下，肺的实质细胞如支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞均可以产生MMP-9[3]。MMP-9可降解细胞外基质，使肺泡毛细血管通透性增加，从而促进多核粒细胞游走，促进炎症反应。TIMP-1是MMP-9的特异性内源抑制因子，可降低这种局部损伤。但是，sCAP患者气道局部的MMP-9和TIMP-1水平如何，笔者尚未见相关文献报道。为此，本研究观察了sCAP患者气道的MMP-9和TIMP-1水平，探讨其在肺炎病情严重程度的诊断价值，并探讨机械通气在sCAP的治疗中对患者的痰MMP-9和TIMP-1水平的影响，现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

收集2013年6月至2014年6月入住广州市胸科医院及广州市红十字会医院呼吸科和中心ICU的CAP住院患者58例，其中31例为sCAP患者，27例为普通CAP患者。按照是否需要机械通气将sCAP患者分为机械通气治疗组(V组)，非机械通气治疗组(NV组)。所有患者均按病情需要予以相应的抗感染、止咳、祛痰等治疗，本研究无需对患者治疗进行任何干预。入选患者及家属均被告知本研究目的、方法及可能出现的风险，签署知情同意书。另选与患者年龄、性别相匹配的20名健康志愿者作为对照组，年龄41～72岁，其中男12例，女8例。

二、诊断标准

sCAP的诊断参照美国感染病学会和美国胸科学会于2007年联合颁布的《成人CAP诊疗指南》中sCAP的诊断标准：①主要指标，包括需强行机械通气、出现感染性休克、需要血管升压类药物；②次要指标，包括呼吸频率≥30次/分、PaO2/吸入氧浓度(FiO2)≤250、多肺叶浸润、意识错乱或定向障碍、尿毒症(血尿素氮≥ 7.14 mmol/L)、白细胞减少(白细胞<4.0×109/L)、血小板减少(血小板<100×109/L)、低体温(核心体温<36℃ )、需要积极体液复苏的低血压[3]。达到以上主要诊断标准的任意1项或者是次要标准的任意3项，即可诊断为sCAP。

三、排除标准

HIV感染者、白细胞<1×109/L或中性粒细胞<0.5×109/L者、器官移植术后者、使用大于或等于1 mg/(kg·d)泼尼松等量的糖皮质激素超过1个月者均不纳入研究。入组24 h内死亡的不纳入统计。

四、研究方法

CAP患者于入院当日或入ICU第1日(健康志愿者于纳入当日)留取静脉血标本5 ml，行血常规、生化、CRP等检查，测定动脉血气，并留取诱导痰标本。sCAP患者另于第4、8日及出院或转科当日收集诱导痰标本。痰液诱导具体操作如下：无需气管插管的患者及健康志愿者在诱导前测定FEV1，然后吸入200 μg沙丁胺醇，在室温下使用超声雾化器雾化吸入3%高渗盐水，收集痰液；气管插管的患者先雾化吸入2 ml沙丁胺醇溶液，在室温下使用呼吸机，雾化吸入3%高渗盐水，持续心电监护及连续监测SpO2，嘱患者咳嗽并以吸痰管吸痰置于留痰器中[5]。取无唾液成分的痰液放于离心管中，加入4倍体积0.1%(1 g/L)二硫苏糖醇(DTT)充分混合，置于37℃恒温水浴箱孵育，振荡 15 min，加入与DTT等体积的 Hanks液，再置于 37℃恒温水浴振荡箱振荡 15 min，3 000 r/min离心20 min，上清液分装，置于-20℃冰箱保存待测相关指标。沉淀细胞用Hanks液悬浮，在血细胞仪上计数细胞总数，用台盼蓝(Trypan)排除法测定细胞的存活率，细胞存活率>50%为合格标本。采用ELISA法检测各时间点痰MMP-9、TIMP-1水平，具体操作按照厂家说明书进行。试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，酶标仪产自芬兰，型号为WellscanMK3。

五、统计学处理

结果

一、2组sCAP患者的临床资料比较

31例sCAP患者中，死亡的7例患者不作连续性分析，最后纳入连续性分析研究的V组患者11例， NV组患者13例。入组时2组患者的年龄、性别构成、白细胞、血CRP、MMP-9及TIMP-1水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；急性生理与慢性健康评分Ⅱ(APACHEⅡ)、PaO2、PaO2/FiO2比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表1。

表1　2组sCAP患者的临床资料比较

注：1 mm Hg=0.133 kPa

二、2组sCAP患者的痰MMP-9水平的动态变化及与对照组的比较

与对照组相比，V组及NV组入院时的MMP-9明显升高(F=239.3，P<0.001)，治疗期间，V组患者痰MMP-9水平下降不明显，至出院或转科当日仍高于对照组(P<0.01)；NV组患者痰MMP-9水平呈下降趋势，至出院或转科当日与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

三、2组sCAP患者的痰TIMP-1水平的动态变化及与对照组的比较

与对照组相比，V组及NV组入院时的TIMP-1水平明显升高(F=260.6，P<0.001)，V组患者的痰TIMP-1水平呈下降趋势，但下降幅度较小，至出院或转科当日仍高于对照组(P<0.01)。NV组患者的痰TIMP-1水平呈下降趋势，下降幅度大，至出院或转科当日与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2　2组sCAP患者的痰MMP-9水平的

注：与同组第1日比较，V组t出院或转科日=4.191，NV组t第4日=4.871、t第8日=7.687、t出院或转科日=12.171，aP<0.01；与同组第4日比较，NV组t第8日=4.341、t出院或转科日=10.744，bP<0.01；与同组第8日比较，NV组t出院或转科日= 6.003，cP<0.01；与对照组比较，NV组t出院或转科当日=19.410，dP<0.01

表3　2组sCAP患者的痰TIMP-1水平的

注：与同组第1日比较，V组t第8日=2.833、t出院或转科日=5.127，NV组t第4日=6.162、t第8日=13.000、t出院或转科日=17.251，aP<0.01；与同组第4日比较，NV组t第8日=5.587、t出院或转科日=10.991，bP<0.01；与同组第8日比较，NV组t出院或转科日=16.142，cP<0.01；与对照组比较，NV组t出院或转科当日=16.88，dP<0.01

四、相关性分析

24例sCAP患者第1日的痰MMP-9水平与APACHEⅡ分值、白细胞呈正相关，与PaO2、PaO2/FiO2呈负相关；其痰TIMP-1水平与APACHEⅡ分值、白细胞呈正相关，与PaO2及PaO2/FiO2呈负相关，见表4。sCAP患者的痰MMP-9水平与TIMP-1水平呈正相关(r=0.599，P<0.01)。

表4　24例sCAP患者的痰MMP-9、

五、痰MMP-9及TIMP-1水平诊断sCAP的ROC分析

sCAP组、普通CAP组患者及对照组志愿者的年龄及性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05)，痰MMP-9及TIMP-1水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表5。sCAP组及普通CAP组患者MMP-9及TIMP-1的ROC显示，痰MMP-9及TIMP-1水平诊断sCAP的ROC曲线下面积分别为0.876和0.793(P均<0.01)，见图1。根据统计结果中可能切点的灵敏度和特异度，计算约登指数，以约登指数最大的切点为临界点，确定该临界点对应的最佳临界值、敏感度、特异度，由此得到MMP-9及TIMP-1水平的最佳临界值为909.61 μg/L。并已知sCAP的患病率为6.3%，以此推算出相应的阳性预测价值及阴性预测值，见表6。

图1　痰MMP-9及TIMP-1水平诊断sCAP的ROC

表5　sCAP组、普通CAP组患者与对照组的痰指标比较

表6　sCAP患者痰MMP-9及

讨论

重症肺炎是由病原体引起的严重的肺部炎症反应。在肺炎诊断的基础上合并1项主要诊断标准或3项次要标准，即可诊断为重症肺炎。其中，需强行机械通气是主要诊断标准之一。此外，重症肺炎患者还可能合并有休克、呼吸频率过快、肺氧合功能差、多肺叶浸润、意识障碍、尿毒症、白细胞或血小板减少、低体温等临床表现，病死率较高，是内科及ICU救治的危重症疾病之一。在细菌毒素、细胞因子等外源性或内源性因素的刺激下，MMP家族由T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎症细胞及血管内皮细胞大量释放。其中MMP-9可降解肺泡壁的胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等几乎所有的细胞外基质成分，诱导多核粒细胞发生迁移并使其形态发生改变，从而提高微血管渗透性，促进多核粒细胞游走，引发器官的损伤和炎症的扩散，导致SIRS，并启动炎症反应的级联放大效应[6-8]。有病理研究显示，MMP-9水平与显微镜下表现的肺脏局部炎症和肺泡破坏程度基本一致[9]。然而，TIMP-1是MMP-9的天然抑制剂，抑制MMP-9在内皮和上皮细胞的基底膜上打孔，有效抑制MMP-9对细胞外基质的降解[3]。已有研究证实，在局部炎症器官中可以检测出高水平的MMP-9及TIMP-1[10]。本研究发现，sCAP患者的痰MMP-9及TIMP-1水平明显升高。相关性分析也发现，患者的痰MMP-9及TIMP-1水平与 APACHEⅡ分值、白细胞正相关，与PaO2、PaO2/FiO2呈负相关。患者的痰MMP-9与TIMP-1水平比较呈正相关。Chiang等[11]研究也发现MMP-9水平与肺炎的严重程度相关。 Maitra等[12]研究也提示，TIMP-l水平的增高是预测重症感染患者病死率的重要指标。杨晓军等[13]研究也发现，早期脓毒症患者MMP-9水平明显升高可能是患者后期感染或全身炎症反应程度加重、MODS发生的重要预警信号。据此认为，MMP-9及TIMP-1参与了sCAP患者炎症反应的启动，并在疾病的进程中发挥着重要作用，其检测值的高低可用于预测肺炎的严重程度。

在临床工作中，我们极其需要有效的预测及评估肺炎病情加重的指标。本研究ROC分析显示，MMP-9及TIMP-1对判定sCAP发生与否的曲线下面积分别为0.876、0.793，提示具备诊断价值。通过ROC分析，我们得到了痰MMP-9的最佳临界值为909.61 μg/L，以此区分sCAP的敏感度为0.677、特异度为0.950、阳性预测值为0.477、阴性预测值为0.978；痰TIMP-1的最佳临界值为1 076.8 μg/L，以此区分sCAP的敏感度为0.613、特异度为0.815、阳性预测值为0.182、阴性预测值为0.969。因此，早期MMP-9及TIMP-1水平测定对于sCAP发生的识别、肺炎病情加重的诊断具有重要的临床价值，可能是疾病加重的敏感因子。研究同时提示，sCAP患者早期MMP-9及TIMP-1水平显著增高可能是感染加重的重要预警信号，临床工作中应尽早采取有效治疗措施阻止病情的发展，其中机械通气是有效的治疗方法之一。

在重症肺炎的救治中，常规抗生素治疗有时难以纠正顽固的低氧血症，此时，机械通气治疗能够帮助患者度过缺氧的难关。本研究发现， V组患者第1日的痰MMP-9水平高于NV组。由此可见，需要机械通气治疗的患者肺内炎症反应较无需机械通气治疗的患者更为剧烈。而无论是否需要机械通气治疗，患者的痰MMP-9及TIMP-1水平均呈现下降趋势。NV组患者的痰MMP-9及TIMP-1水平下降较明显，而V组患者的MMP-9及TIMP-1水平下降不明显。这可能因为机械通气治疗组患者的基础MMP-9水平比较高，也可能与机械通气引发的呼吸机相关性肺炎有一定关系。肺泡内皮细胞受到的机械牵张应力与MMP的释放有一定关联。机械通气的压力和细菌感染后的抗原刺激均可以激发核因子-κB，引发细胞因子的释放从而诱导MMP-9的释放与激活。Moriondo等[14]的研究发现，机械通气，甚至是生理性的低潮气量，也会严重影响肺的组织结构，暴露肺实质，促进呼吸机相关性肺炎的发展。但也存在不同的观点，Albaiceta等[15]则认为MMP-9可以通过增加中性粒细胞浸润，或者通过调节细胞因子对气道压力的反应来对抗呼吸机相关性肺炎。此外，经过机械通气治疗的患者因侵入性操作以及免疫功能下降等因素，通常较非通气治疗的患者存在更高的细菌感染风险。连宁芳等[16]的研究发现，重症肺炎患者细胞免疫功能较非重症肺炎患者下降，免疫功能减退可能是患者发生重症肺炎的原因之一。因此，对于机械通气患者维持较高的MMP-9水平而言，可能同时存在感染及通气的双重因素。

总之，MMP-9作为细胞外基质的主要降解酶和内皮损伤的标志物，在肺部炎症反应中发挥着重要作用。早期MMP-9及其抑制因子TIMP-1水平的测定对于肺炎发展的严重程度的诊断具有一定的参考价值，对于sCAP患者病情的评估也可能有一定的临床意义。但由于缺少更多不同时间点的观测数据以及更多的样本数量，目前所得临界阈值有待进一步研究。

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(本文编辑：林燕薇)

临床研究论著

作者单位：510080 广州，广东药学院附属第一医院内分泌科