脂肪活性检测方法的研究进展

裴进洪 综述 李青峰 审校

脂肪活性检测方法的研究进展

裴进洪 综述 李青峰 审校

脂肪细胞活性检测方法用于在体外判断脂肪细胞的活性，包括一般细胞活性检查法，和脂肪细胞特异性检验法。我们对常用的脂肪细胞活性检测方法的原理、特性，以及相关应用情况进行综述。

脂肪细胞活性检测特异性

1893年，Neuber首先提出了自体脂肪移植的概念。上世纪80年代，随着脂肪抽吸技术的出现，自体脂肪颗粒的获取更加简便。1986年，Illouz[1]将脂肪抽吸术所获得的脂肪，注射到软组织缺损的部位，开创了脂肪细胞移植。自体脂肪细胞移植无免疫及排斥反应，取材容易、组织损伤小，同时可起到供区减脂瘦身的作用。但脂肪移植的存活率较低，且效果难以预测，移植的脂肪呈现进行性体积缩小。为了寻找影响脂肪活性的因素，从而提高移植脂肪的存活率，出现了各种检测脂肪细胞活性的方法。主要有通过检测细胞膜完整性的台盼蓝染色、荧光染色，检测亚细胞器功能的MTT法、XTT法、CCK-8法、alamarBlue、JC-1、溴-脱氧尿嘧啶掺入法，检测细胞酶功能的LDH释放法、GAPDH，以及检测细胞死亡标志物的FITC Annexin V等。本文对常用的脂肪细胞活性检测方法的原理、特性，以及相关应用情况进行综述。

1 细胞膜完整性检测

1.1 台盼蓝染色

台盼蓝染色是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定方法之一。胞膜结构完整的正常活细胞能够排斥台盼蓝，因此台盼蓝不能够进入胞内，而死亡细胞或细胞膜不完整的细胞可被台盼蓝染成蓝色。通常认为，细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。台盼蓝与中性红作用相反。

台盼蓝染色操作简便，可快速区分活细胞和死细胞，费用低廉。随着流式细胞仪的发展，将实验结果数据化变得简便而准确。

Hwang等[2]应用台盼蓝染色法检测了脂肪细胞活性在不同冷藏条件下的变化，发现该方法由于计数时焦平面的选择、颗粒识别的准确性等，易高估细胞活性。台盼蓝染色显示的活细胞，会在荧光显微下呈现为死细胞。所以台盼蓝染色应和其他检测方法同时应用，以提高准确性。

1.2 荧光染色法

荧光染料在吸收紫外线或可见光后，能把短波长的光转变为长波的可见光而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。荧光染色法是利用荧光染料的这种性质来检测细胞的活性。荧光染料主要分为不能渗透活细胞胞膜的PI（Propidium iodide）、EB（Ethidium bromide）、7-AAD，和能渗透活细胞胞膜的AO（Acridine Orange）等。荧光染色法能与另一种荧光染料或其他染料同时使用，如AO-EB双染法等，可同时染色凋亡细胞和活性细胞，使分析实验结果更简便而准确。同时，由于灵敏度高，操作方便，被广泛应用于荧光免疫、荧光探针、细胞染色等。但与其他基于荧光染料标记的实验一样，需要使用荧光显微镜或流式细胞仪。

1.2.1 FDA/PI

Son等[3]为了检验离心对脂肪细胞和脂肪干细胞活性的影响，采用FDA-PI染色法。FDA是能通过细胞膜的细胞酶底物，进入活细胞后，从无免疫荧光的FDA，被细胞酶转换成绿色免疫荧光的“Fluorescin”，它是细胞活性的指标。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋，从而产生红色荧光。但Boyd等[4]认为，FDA/PI法影响因素过多，很难掌握，难以避免操作过程中的主观因素。因此，该方法的检测结果并不准确。

1.2.2 Calcein-AM和碘化丙啶（PI)免疫荧光试验

Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，分别可对活细胞和死细胞进行染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，能脱去AM基，产生的Calcein（钙黄绿素），能发出强绿色荧光。因此，Calcein-AM仅对活细胞染色。另外，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；用545 nm激发，则仅可观察到死细胞。

与同类试剂比较，Calcein细胞毒性较低，不会抑制任何细胞的正常生理功能或动态变化[5]。Tai等[6]通过比较Calcein-AM/PI和Cr51检测细胞毒性结果，发现与标准的Cr 51-释放法所得结果相一致，因此认为使用Calcein活性检测的实验结果是十分可信的。但Calcein-AM的ester部位遇到水分会分解，使用后要在-20℃下密闭冷冻保存，并且PI有致癌可能，对操作者有一定的安全风险。

1.2.3 Perilipin免疫荧光染色

Perilipin是脂肪细胞脂滴表面富含有的蛋白，不仅在成熟脂肪细胞分化的前体脂肪细胞内起作用，在脂肪细胞内对甘油三酯的存储和分解也具有重要的调控作用。Perilipin保护脂肪组织，减少水解，可影响脂肪细胞的活性及分化[7]。这种方法针对脂滴表面蛋白进行免疫荧光，对脂肪细胞活性检测具有特异性。通过免疫荧光染色，可间接反映出细胞数量，脂滴周围蛋白被染色，呈绿色的细胞为活细胞，未染色的为死细胞。Perilipin免疫荧光染色法是近年来检测脂肪细胞活性的首选方法之一，具有特异性，操作简便，可区分活细胞和死细胞，准确性高，可用流式细胞仪检测，并且实验结果可数据化，简便而准确[8]。

2 亚细胞器功能检测

2.1 MTT法、XTT法、CCK-8法

MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT还原为不溶水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540 nm或720 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

MTT法使用方便，不需要放射性同位素和有机溶剂，检测快速、灵敏度高、可重复性高、对细胞毒性小，并且价格低廉，成为细胞活性检测最常用的方法。但是，因为MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，对实验结果的准确性有一定的影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对操作者具有危害行。为了解决该问题，XTT、CCK-8等水溶性的四氮唑盐类被应用于此类研究。

XTT的化学名为2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。当XTT与电子耦合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。

CCK-8试剂中含有WST-8，化学名为2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量，其荧光原理与XTT、MTT相同。

XTT和MTT法使用方便、检测快速、灵敏度高，XTT重复性优于MTT，但是XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。与MTT法相比，CCK-8和XTT法的费用较高，并且由于是贴壁培养的细胞，在读吸光值时细胞培养板底部附着的细胞可能会对数值有一定的影响，因此在加入CCK-8的3～4 h后，将上清液重新吸取到另一干净的酶标板中进行读值，可提高检测的准确性。

2.2 alamarBlue一步荧光测定法

alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原，产生荧光及颜色变化，可用于定量。此试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂，在氧化状态下呈现紫蓝色，无荧光性；而在还原状态下，呈粉红或红色荧光，其吸收峰为530～560 nm，散射峰为590 nm。

alamarblue特异性低，但灵敏度高，重复性好，结果差异小，使用方便，无需预先标记靶细胞及离心、洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。染料浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。另外，还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。含胎牛血清及酚红的培养液也不干扰测定结果。但由于alamarBlue分解产物偏红，不能用粉红色培养基，并且培养时间也较长，试剂成本较高[9]。

2.3 JC-1

线粒体膜电位是检测细胞活性的关键因素之一。线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性指标。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential）的理想荧光亲脂性阳离子探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物（J-aggregates），可产生红色荧光（590 nm）；膜电位低于120 mV时，JC-1为单体，发出绿光（540 nm）。常用红、绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变，可轻易检测到细胞膜电位的下降；同时，也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变，作为细胞凋亡早期的一个检测指标。该方法灵敏度高，重复性好，实际观察时以常规观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。Debnath等[10]采用JC-1来检验chitosan水凝胶里培养的脂肪细胞的增殖分化潜力和活性。

2.4 溴-脱氧尿嘧啶掺入法（BrdU incorporation assay）

5′-溴-脱氧尿嘧啶（5′-bromo-deoxyuridine，BrdU）与胸腺嘧啶结构相似，其特点是胸腺嘧啶Ⅲ期嘧啶环与5位C连结的甲基被Br代替，在DNA合成过程中能与胸腺嘧啶一样掺入其中，固定通透后，通过检测BrdU标记的细胞能定性、定量地反应细胞的增殖状态。Liang等[11]报道，进行增殖能力试验时，由于BrdU可从大量活的但不增殖（如在G0期）的细胞中选择性地测定增殖细胞，因此灵敏度比只能测活细胞总数增加的MTT法高，但如果是测活性，用MTT法更合适。有些药物会抑制DNA合成，而使BrdU检测增殖能力产生增殖细胞数减少和DNA抑制的双重影响，从而产生部分假阳性。

3 细胞酶检测

3.1 乳酸脱氢酶（LDH）释放法

LDH正常时不能通过细胞膜，当细胞损伤或死亡时，可释放到细胞外，使培养基内乳酸脱氢酶浓度增高。因此，细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤率，也可以计算细胞生存率。本法操作简便快捷、灵敏度高，敏感性、客观性、实际成本及测定速度都高于化学染色法和MTT法，并且自然释放率低[12]。但是，培养基、pH值、温度及底物显色剂和终止剂等，都会影响检测结果，实际操作很难掌握[13]。

3.2 甘油-3-磷酸脱氢酶的同工酶检测（GAPDH）

利用合成的儿茶酚胺（异丙肾上腺素）可激活β-肾上腺素受体。这一过程可激活腺苷酸环化酶，将ATP转换为cAMP。之后，cAMP通过激素敏感性脂肪酶，激活三酸甘油酯的水解过程，脂解作用可通过测定吸收峰在570 nm处的比色产物而确定，该吸收量与所含的甘油量成正比。Ferguson等[14]应用此法，检测通过LipiVage system取得的自体脂肪标本的细胞内酶活性。虽然这是一种具有脂肪特异性的检测法，但从受损细胞分离出来的细胞外G3PDH也能被检测到，进而影响结果的准确性。

4 细胞凋亡标记物检测

4.1 FITC Annexin V

在死细胞里，细胞膜phospholi822pid phosphatidylserine（PS）是从内侧细胞质到外侧细胞质分离出来的。Annexin V是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS密切相关，能和细胞膜PS结合；包含FITC的Annexin V能和荧光素结合。FITC Annexin V和PS密切相关，能和荧光素结合，从而可以把有利证据提供给流式细胞检测分析。比如，活细胞对FITC Annexin V和PI均阴性，晚期凋亡细胞对FITC Annexin V和PI均阳性。Charles-de-Sá L等[15]应用此法，检测抽脂时负压大小、仪器种类、喷嘴直径对脂肪细胞活性的影响，但其结果无明显差异。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）在凋亡晚期的细胞和死细胞中能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色，因此将Annexin V与PI联合使用，可以同时检测活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。此法灵敏度高、重复性好、使用方便，但只适用于实验，不适用于临床检测。细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，都会影响实验结果，难以掌握并实际运用。

综上所述，多种检测技术的相继出现，弥补了旧方法的缺点，提高了检测结果。但准确度、灵敏度、费用或技术难度等，还是存在种种问题。相信随着实验技术和相关学科的不断进步，将会有更经济、有效的检测方法出现，从而解决上述问题。

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Research Progress of Lipocyte Viability Assay

BAE Jinhong,LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China. Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@yahoo.com).

Lipocyte viability;Assay;Specificity

R622

B

1673－0364（2016）06－0388－03

2016年7月15日；

2016年8月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.017

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@yahoo.com）。

【Summary】Lipocyte viability assay is the standard for judgment of lipocyte's viability in vitro.It not only involves normal cell viability assay but also includes lipocyte-specific assessment.In this article,the principle,advantages,disadvantages and related applications of lipocyte viability assay were reviewed.