miRNA在间充质干细胞成骨分化过程中的作用

陈军宝 综述 肖 苒 曹 谊 林审校

·综述·

miRNA在间充质干细胞成骨分化过程中的作用

陈军宝 综述 肖 苒 曹 谊 林审校

间充质干细胞作为种子细胞在组织工程和再生医学领域有极大的应用前景，尤其是在骨组织工程中的应用受到了广泛关注。间充质干细胞的成骨分化机制复杂，受到多方面因素的影响，不同种类的miRNA可分别参与抑制或促进间充质干细胞的成骨分化，在其分化过程中具有核心作用。本文对不同作用的miRNA进行归类和总结，期待为未来的研究提供思路。

间充质干细胞微小核糖核酸成骨分化信号通路

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作为干细胞家族的重要成员，可分离自骨髓、脂肪、骨骼肌、滑膜、脐带及脐带血等组织，因其具有多向分化、自我复制、造血支持、免疫调控等特点，在干细胞治疗、基因治疗、组织工程和再生医学等领域有重要的应用价值[1-2]。近年来的研究发现，微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）可通过调控靶基因的表达，参与调节干细胞的各种生物学功能，尤其是在MSCs成骨分化与成熟过程中的作用日益受到重视[3]。本文就miRNA在间充质干细胞成骨分化过程中的调节作用进行综述。

1 miRNA简介

miRNA是一类长度为20～24 bp的非编码单链RNA分子，广泛存在于动植物、真菌等各类生物体内，主要通过调控基因表达参与多种病理生理过程。1993年，Lee等[4]在研究秀丽隐杆线虫突变表型时首次发现miRNA，迄今已发现了千余种miRNA，现已明确其参与多种细胞生物学过程，如细胞增殖、凋亡、分化、代谢、氧化应激等[5]。

2 miRNA与MSCs的成骨分化的关系

miRNA在间充质干细胞成骨分化过程中具有核心作用，通过对信号通路中不同水平的关键分子的调节，构成间充质干细胞成骨分化的调控网络，从而达到对干细胞成骨的精确调控。Zhang等[6]发现，在用抗坏血酸（50 μg/mL）诱导的大鼠MC3T3-E1成骨细胞系和MLO-A5成骨前体细胞系成骨分化过程中，MC3T3-E1成骨细胞系中有51种miRNA的表达量发生显著改变，其中有31种miRNA的表达减少；在MLO-A5成骨前体细胞系中有20种miRNA的表达量发生显著改变，其中有6种miRNA的表达减少。研究证实了不同种类的miRNA可通过其靶基因作用于经典Wnt信号通路，而调控MSCs的成骨分化。Wang等[7]将置于PHBHHx带沟槽材料上的大鼠骨髓来源的MSCs细胞培养72 h后，与在滑面PHBHHx材料上培养的MSCs相比较，分析miRNA的表达谱，发现有18种miRNA出现差异性的表达，其中14种miRNA的表达量明显上调（包括miR-140，miR-210，miR-214等），4种miRNA表达明显下调（包括let-7a，let-7i，miR-146a，miR-196a），进一步将差异性表达的miRNAs与其靶基因的作用进行分析，发现MSCs成骨分化成熟主要与MAPK、Smad信号通路相关，其中miR-93、miR-214、miR-324-3p、miR-503、miR-674-5p通过其相应的作用靶点调控MAPK信号通路，而miR-93、miR-503、miR-140、miR-298、miR-146a、miR-351则主要调控Smad信号通路。miRNA在MSCs成骨细胞分化过程中的调控信号网络复杂，是研究的难点。

3 MSCs成骨分化的影响因素

MSCs的成骨分化成熟过程受多种因素的影响，包括种子细胞的来源、分离纯化方式、诱导分化策略、血管化进程等[8]。Guillot等[9]对胎儿骨髓、外周血、肝脏3种不同组织来源的MSCs的分化能力进行比较，发现骨髓来源的MSCs成骨分化能力最强，肝脏来源的MSCs成骨分化能力最弱。其他因素，如细胞生长的微环境、支架材料、生物力学信号等，也会对MSCs的成骨分化成熟产生影响。

4 miRNA在MSCs的成骨分化过程中的作用

miRNA通过与靶基因mRNA的相互作用来调节MSCs成骨分化过程中的转录因子、信号分子及其相对应的受体的功能。不同种类的miRNA可分别参与调节TGF-β、MAPK、PI3K、Wnt、Notch等多条细胞信号转导通路，调控MSCs的分化及成熟[10]。

4.1 促进成骨分化

Zhou等[11]用伊班磷酸盐处理牙周膜间充质干细胞，其miRNA-18a的表达量明显升高，提示miRNA-18a可能参与伊班磷酸盐诱导的牙周膜间充质干细胞向成骨细胞分化的过程。Liu等[12]研究发现，来源于牙周炎患者的牙周膜间充质干细胞成骨分化能力明显降低，其机制是炎症因子IL-1β和TNF-α可上调Smurfl的表达水平，而Smuffl可负性调控MSCs的成骨分化，miRNA-17能通过抑制Smuffl的表达，从而促进牙周膜中MSCs的成骨分化。Huang等[13]研究发现，在人脂肪来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，miRNA-22及其靶基因HDAC6是MSCs向成骨分化的重要调节因子，高表达的miRNA-22通过抑制HDAC6的水平，从而促进成骨细胞的生成，同时还可抑制脂肪组织的形成。Li等[14]发现miRNA-26a能促进VEGF的分泌，调节骨髓来源的MSCs的成骨分化和血管形成过程，体内实验研究发现在骨骼缺损的周围组织中miRNA-26a的表达水平增高，骨组织的再生能力和血管化能力明显增强。Wang等[15]研究发现，在间充质干细胞系hFOBl.19细胞向成骨细胞分化的过程中，miRNA-27的表达量在其分化的第12小时开始增加，在分化的第72小时明显增加，和对照组相比差异有统计学意义，他们还证实miRNA-27的水平与β-连环蛋白表达量呈正相关，β-连环蛋白可与结肠腺瘤性息肉病（Adenomatous polyposis coli，APC）蛋白形成复合物而发生降解，miRNA-27可直接抑制APC基因的表达，减少细胞内信号分子β-连环蛋白的降解，最后细胞内不断累积的β-连环蛋白可激活经典Wnt信号通路，促进hFOBl.19细胞向成骨分化成熟。Hu等[16]研究发现，hFOBl.19细胞向成骨细胞分化的过程中，miRNA-142-3p表达增多，抑制miRNA-142-3p的表达则对hFOBl.19细胞的成骨分化有抑制作用，其机制也可能与miRNA-142-3p抑制APC基因的蛋白表达，激活Wnt信号通路有关。Suh等[17]发现，miRNA-29b促进hMSCs的成骨分化成熟，还干扰成骨分化的负向调控基因（如：HDAC4、CTNNBIP1、DUSP2等），而间接促进骨的生成，这些基因可分别通过Smads、ERK、Wnt等信号通路，影响间充质干细胞的成骨分化。Hassan等[18]发现，miRNA-218能够促进骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞，其机制是miRNA-218能够抑制DKK2、SFRP2、SOST等Wnt信号通路的负性调控因子，间接激活Wnt信号通路。因此，miRNA-218与Wnt信号通路形成的正反馈可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。Bhushan等[19]将骨形态生成蛋白-2/6（BMP2/6）诱导小鼠C2C12和MC3T3细胞成骨分化，在细胞分化24 h后，可检测到miRNA-181a表达量明显增加，发现miR-181a可直接作用于Tgfbi和TβR-I靶点，通过调节TGF-β和Wnt信号转导通路，促进C2C12和MC3T3细胞的成骨分化进程。

4.2 抑制成骨分化

Li等[20]研究发现，miRNA-17家族成员（主要是miRNA-17-5p和miRNA-106a）可抑制脂肪来源的间充质干细胞（hADSCs）向成骨分化，但可促进其向脂肪组织的分化成熟。发现hADSCs在向成骨细胞分化的过程中，BMP-2、TAZ和MSX2的mRNA表达水平在分化的第4天达到峰值，然后逐渐降低。BMP2（TGFβ/BMPs信号通路成员）作为miRNA-17-5p和miRNA-106a的作用靶点，参与调节骨的发生、骨骼形成和骨折愈合，miRNA-17-5p和/或miRNA-106a可抑制BMP2的表达水平，干预hADSCs的成骨分化。Zeng等[21]证实，在hADSCs向成骨细胞分化的过程中，抑制miRNA-100的功能可增加BMPR2的表达，其机制是BMPs与BMPR2的结合后可激活BMPR1，进而使胞内的Smads信号分子发生磷酸化，抑制成骨细胞的分化成熟。Wei等[22]研究发现，miRNA-34家族成员（miRNA-34b和miRNA-34c）可以通过抑制核基质蛋白SATB2的表达，从而抑制小鼠成骨细胞的分化成熟，并且能通过减少CDK4、CDK6和CyclinD1的蛋白积累，抑制成骨细胞的增殖。Yang等[23]证实，在小鼠原代成骨细胞的体外矿化过程中，miRNA-93的表达量明显降低，miRNA-93的靶基因直接作用位点在转录因子Sp7的编码区内。他们发现，Sp7作为成骨细胞矿化过程的关键分子，高表达的Sp7可以与miRNA-93的启动子区结合抑制其转录，从而抑制成骨细胞的矿化进程。Mizuno等[24]研究发现，在BMP4诱导的小鼠间充质干细胞（ST2细胞）向成骨细胞分化的过程中，ST2细胞内高表达的miRNA-125b可直接作用于其靶基因ErbB2，在ST2细胞分化的早期抑制细胞的增殖和成骨分化。Eskildsen等[25]证实，miRNA-138可通过抑制FAK蛋白表达来调节人骨髓来源的间充质干细胞的成骨分化，过度表达的miRNA-138使FAK蛋白的磷酸化减弱，影响FAK下游信号的转导；破坏miRNA-138的功能后，FAK蛋白的磷酸化增强，可激活其下游的ERK1/2信号通路，使Runx2发生磷酸化，增强Osterix的表达，促进细胞的成骨分化。TNF-α可通过上调miR-155的表达，以抑制BMP-2诱导的MC3T3-E1细胞的成骨分化，TNF-α可能通过激活SAPK/JNK信号通路抑制BMP-2诱导的成骨分化[26]。Tome等[27]证实，高表达的miRNA-335可破坏间充质干细胞的增殖、迁移和分化，且Wnt3a信号可以正向调节miR-335的表达，从而抑制间充质干细胞的成骨分化和增殖；IFN-γ的作用与Wnt3a相反，可以负向调节miRNA-335的表达，促进细胞的成骨分化成熟。研究发现，ERRγ可促进miRNA-433在小鼠骨源性间充质干细胞谱系C3H10T1/2细胞中的表达，而在BMP-2诱导的细胞成骨分化过程中，ERRγ和miR-433的表达量均减少。此外，在C3H10T1/2细胞成骨分化的过程中，高表达的ERRγ和miR-433可抑制成骨分化标志基因Runx2和ALP的表达，说明miR-433可负向调控C3H10T1/2细胞的成骨分化成熟[28]。

5 展望

间充质干细胞是组织工程成骨种子细胞的重要来源，在骨缺损修复与再造领域具有广阔的应用前景。miRNA作为调控间充质干细胞向成骨细胞分化的关键调控因子之一，在间充质干细胞向成骨细胞分化及成熟过程中的作用机制尚未完全阐明，miRNA靶基因的功能特异性、miRNA之间的相互作用，以及环境因素的作用影响等，是未来研究的重点。随着研究的不断深入，间充质干细胞向成骨细胞的分化机制会不断被阐明，从而为骨组织工程提供新的理论基础和实验依据。

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Role of MicroRNA in the Process of Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

CHEN Junbao1,XIAO Ran2,CAO Yilin2.1 The Fifth Department;2 Research Center,Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

Mesenchymal stem cells;MicroRNA;Osteogenic differentiation;Signal pathway

Q813.1+1

B

1673－0364（2016）06－0375－03

2016年3月12日；

2016年5月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.013

100144北京市中国医学科学院整形外科医院整形五科（陈军宝）；100144北京市中国医学科学院整形外科医院研究中心（肖苒，曹谊林）。

曹谊林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

【Summary】Mesenchymal stem cells have great application prospects in tissue engineering and regenerative medicine as seed cells,especially have evoked the extensive attention in the application of bone tissue engineering.Mechanisms of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells are complicated.It is affected by various factors.Different kinds of miRNA can inhibit or promote the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells respectively,it plays a key role in the differentiation process.In this paper,miRNA in different roles was classified and summarized,expecting to provide ideas for future research.