黑色素瘤抗体治疗研究进展

赵 辉 孙梦妍 王宇翀 薛春雨

黑色素瘤抗体治疗研究进展

赵 辉 孙梦妍 王宇翀 薛春雨

黑色素瘤是一类起源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤，易发生远处转移，转移性黑色素瘤患者的预后很差。近年来，免疫治疗逐渐成为黑色素瘤治疗的新方向，越来越多的免疫药物被用于临床治疗。其中，对T细胞肿瘤免疫研究日益深入，多个有治疗意义的T细胞调节通路位点和共刺激分子被发现，并被用于加强对黑色素细胞瘤的免疫反应。本文就两种单克隆抗体，即程序死亡分子1（PD-1）和抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4），以及两种共刺激分子OX40和4-1BB在近年的研究进展进行综述。

黑色素瘤单克隆抗体共刺激分子

黑色素瘤是起源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤，好发于皮肤，也可发生于眼、鼻腔、肛管直肠、淋巴结等组织。美国2014年黑色素瘤新发病例为76 100例[1]。尽管黑色素瘤发病率仅占所有皮肤类肿瘤的2%不到，但却占了因皮肤类肿瘤死亡病例的绝大部分。在我国每年新发病例数约2万，年增长率为3%～5%，虽然发病率较低，但死亡率极高。

标准的皮肤黑色素瘤治疗包括肿瘤的扩大切除，以及前哨淋巴结活检；若前哨淋巴结受累，则需进一步扩大手术范围。对于原位深度浸润的黑色素瘤以及已发生淋巴结转移的病例，需要进行包括手术、免疫治疗、化疗甚至放疗的综合治疗。对于晚期患者，在姑息性手术降低瘤体负荷的前提下，需综合进行化疗、放疗以及靶向治疗等[2]。

早期的黑色素瘤在正确的治疗下有很高的治愈率[1-2]。但是黑色素瘤易发生远处转移，成为影响黑色素瘤生存率的首要因素，也是治疗的最大障碍。原位黑色素瘤的5年生存率为98%；当出现局部转移或远处转移，5年生存率仅为62%和16%。晚期的黑色素瘤尚无安全有效的治疗药物。免疫治疗药物的出现，给晚期黑色素瘤的治疗带来了新的转机。

随着人们对免疫系统的研究，越来越多的黑色素瘤免疫治疗相关靶点被发现。其中，T细胞通路的研究最为广泛，研制了细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4，CTLA-4）和程序性死亡分子-1（Programmed Death-1，PD-1）等抗体。此外，共刺激通路OX-40（CD134）和4-1BB（CD137）的研究也为黑色素瘤的治疗指引了新的方向。本文将对CTLA-4、PD-1以及共刺激因子OX-40、4-1BB在黑色素瘤治疗中的研究进展进行综述。

1 抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）

1.1 CTLA-4临床前研究

T细胞的免疫应答首先需要抗原提呈细胞（Antigen Pre-senting Cell，APC）提呈抗原，形成组织相容性复合物，与T细胞受体结合激活初始信号通路，在共激活因子的协作下，通过第二信号通路扩大信号。其中，T细胞上的共刺激分子CD28和APC细胞表面的CD80/CD86起着重要的调节作用。CTLA-4在T细胞抗原提呈后被释放，作为重要的调节通路下调T细胞免疫应答[3]。CTLE-4作为CD28的同系物，通过竞争性结合CD80而产生抑制信号，阻断T细胞受体信号传导至细胞核，下调T细胞免疫活性[4]。如果能阻止CTLA-4和CD80的结合，拮抗其对T细胞免疫的抑制，是否就能打破肿瘤的免疫耐受？有研究将抗CELT-4抗体用于各种肿瘤的小鼠模型，证明在接受抗CELT-4抗体治疗后，肿瘤生长受到抑制，甚至部分得以治愈[5]。这给肿瘤治疗带来了新的希望，目前通过临床评估的抗CTLA-4抗体有两种：Ipilimumab和Tremelimumab。

1.2 CTLA-4的临床研究

1.2.1 Ipilimumab

Ipilimumab是抗CTLA-4的人IgG1单克隆抗体，通过结合CTLA-4从而阻断由CTLA-4产生的抑制信号[6]。早期的临床试验确定了Ipilimumab的治疗剂量，并被FDA批准用于黑色素瘤的Ⅲ期临床试验，也是第一个因总生存期获益而被FDA批准用于中晚期黑色素瘤治疗的药物。

初始阶段Ⅲ期临床试验入组了676名已接受系统治疗无效并广泛转移的晚期黑色素瘤患者，随机分为Ipilimumab组（n=137）、Ipilimumab+gp100组（n=403）和gp100组（n=136），Ipilimumab的治疗剂量为3 mg/Kg，3周为一个疗程，共治疗4疗程。结果显示，各组总的起效率分别为28.5%、20.1%和11%。尽管客观上肿瘤控制率不高，但与对照组患者的生存率相比，接受Ipilimumab治疗的患者生存率显著提高[7]。2011年，一项Ⅲ期临床试验中，黑色素瘤患者被随机分为两组，Ipilimumab+dacarbazine和dacarbazine+安慰剂。3年的随访发现，Ipilimumab+dacarbazine组的总体生存期为11.1个月，dacarbazine+安慰剂组为9.1个月[8]。可见Ipilimumab对中晚期黑色素瘤的治疗有特殊的临床意义。

Ipilimumab的免疫毒性作用被广泛研究[9-10]，其毒副作用包括皮疹、瘙痒、内分泌失调、腹泻、溃疡性结肠炎、发热、疲劳和肝细胞损伤。副作用通常在第2或者第3个疗程出现，尽管这些副作用发生的具体机制目前尚未明确，但预测可能是Ipilimumab拮抗CTLE-4导致T细胞过度激活所致。通过使用免疫抑制剂，如类固醇、麦考酚酸酯等，能缓解此类副作用。类固醇通常在使用1周内缓解免疫毒性症状，此后类固醇使用剂量可逐渐降低。以强的松为例，治疗的起始剂量为0.5 mg/Kg，若发生严重的免疫毒性反应，可将剂量提升至1～2 mg/Kg。当症状得到缓解，缓慢减少强的松使用剂量。随着类固醇使用剂量逐渐减少后可继续进行Ipilimumab的治疗。Weber等[11]发现，Ipilimumab的治疗效果并未受到类固醇激素的影响而降低。

此外，还有数个进行Ipilimumab治疗的晚期黑色素瘤患者的长期随访研究，都证实了Ipilimumab能有效提升晚期黑色素瘤患者的存活率[12-13]。其中，Schadendorf的随访显示有18%的患者生存时间达5～10年；Lebbe也观察到了显著的治疗效果，5年生存率超过20%。

1.2.2 Tremelimumab

Tremelimumab是抗CTLA-4的人IgG2单克隆抗体，它的半衰期（22 d）比Ipilimumab更长（15.4 d）。但是，Tremelimumab目前尚未被FAD认证用于肿瘤治疗。Ⅲ期临床试验表明，相比较达卡巴嗪、替莫唑胺等化疗药物，Tremelimumab并未显示出明显的优势，总体生存周期为12.4个月（化疗组为10.7个月），但是其肿瘤缓解期较化疗组更长[14]。

1.3 抗CTLA-4抗体作用机制

抗CTLA-4导致肿瘤消亡的作用机理尚未明确，可能与使用抗CTLA-4后引起的肿瘤T细胞浸润相关[15]。此外，在瘤体中还发现了CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating Lymphocytes，TIL）水平的升高，这表明了不只是T细胞的浸润，还有更多的免疫细胞被激活。TCR库是判断CD8+T细胞抗黑色素瘤细胞活性的潜在标志物，在使用抗CTLA-4抗体后检测外周血能发现TCR库的扩宽[16]。另外一种评估T细胞反应的方法是检测调控T细胞的CTLA-4水平。CTLA-4在瘤内调控T细胞中亦有表达，Selby等[17]在鼠模型中发现，抗CTLA-4抗体减少了调控T细胞活性；同时，效应T细胞水平则出现升高。这一T细胞亚型比例的变化可能导致了T细胞抗肿瘤能力的增强。抗CTLA-4抗体的作用可能还与其抗体亲和力相关。与Fcγ受体亲和力强的抗CTLA-4抗体在动物模型中表现出更强的抗肿瘤能力[18]，提示了Tremelimumab这种结合能力较弱的抗CTLA-4抗体的临床活性可能较低。

2 程序性死亡分子-1（PD-1）

2.1 PD-1临床前研究

PD-1结构与CTLA-4相似，也属于CD28超家族，是一种重要的T细胞免疫抑制因子。PD-1是一种扩膜蛋白受体，在TCR抗原提呈后上调表达。PD-1有两种配体，PD-L1和PD-L2。T细胞激活后，在APC、巨噬细胞、T细胞、B细胞表面都能发现这两种配体表达上调。其中，PD-L1也在包括黑色素瘤在内的很多肿瘤细胞中表达[18]。PD-1和PD-L1的表达抑制T细胞免疫应答，尤其是慢性感染和肿瘤所致的持续性抗原暴露[19]。当PD-1和PD-L1被激活，PD-1细胞上的SHP-2出现脱磷酸作用，脱磷酸后的SHP-2抑制邻近的T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）信号传导通路，导致细胞因子产生减少，细胞毒性降低[20]。在浸润于肿瘤中的调控T细胞、特异性CD8+T细胞中都发现PD-1的高表达[21-22]，使得细胞毒性CD8+T细胞减少了细胞因子的表达，PD-1+调控T细胞过度增殖又进一步降低了对肿瘤的免疫反应。实验室研究也发现，使用抗PD-1抗体阻断PD-1通路能在多种肿瘤模型中增强免疫系统对肿瘤的反应[23]。

2.2 Nivolumab

第一种被检测用于治疗黑色素瘤的抗PD-1抗体是一种高亲和性的人LgG4，命名为Nivolumab[24]。早期的Ⅰ期临床试验，纳入了239名患者（黑色素瘤、肾癌、肺小细胞癌），其中94例黑色素瘤患者中有26位对Nivolumab出现有效应答。用免疫组化分析了42例预处理的瘤体标本发现，17例PDL1-的患者未出现应答，而PD-L1+患者中有36%出现应答[25]。另一项有418名未进行过系统治疗的黑色素瘤患者的随机对照研究中，对比了Nivolumab（n=210）与达卡巴嗪（n=208），发现接受Nivolumab治疗的患者有更好的治疗效果与更高的生存率[26]。在进行中的一项随机分组的非盲Ⅲ期药物试验中，入选患者为接受过免疫治疗后的带有BRAF变异的黑色素瘤患者，比较了Nivolumab与传统化疗药物（达卡巴嗪或者联合运用紫杉醇与卡铂），发现Nivolumab的有效率（32%）高于化疗药物（11%）。FDA于2014年12月批准了Nivolumab用于经过Ipilimumab或者BARF抑制剂治疗后的黑色素瘤的后续治疗。

2.3 Pembrolizumab

另一种抗PD-1抗体是Pembrolizumab，也是人源性IgG4，其靶点作用于PD-1、PD-L1和PD-L2之间的相互作用[8]。173例经过至少2个疗程Ipilimumab治疗的不能切除或已发生转移的黑色素瘤患者被纳入研究，治疗剂量分为2 mg/Kg（n=89）和10 mg/Kg（n=84），两组的有效率均为26%。而其免疫毒性虽然被发现，但发生率和严重程度较抗CTLA-4抗体低。疲劳、瘙痒和皮疹是最常见的副作用，在两组间比较并未发现副作用发生率的差别。FDA于2014年9月批准了Pembrolizumab用于经过Ipilimumab或者BARF抑制剂治疗后的带有BARF变异的黑色素瘤的后续治疗。

2.4 MPDL3280A

MPDL3280A是另一种已经进入临床试验的抗PD-L1抗体，这种IgG1抗体被设计减小抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent Cell-mediated Cytotoxicity，ADCC）。加入这种设计的原因是因为抗IgG4抗体加强ADCC，并可能导致PD-1相关联的T细胞凋亡[27]。一项有41名转移性黑色素瘤患者纳入的药物试验发现，29%患者观察到明显的疗效，而没有出现严重的毒副作用。通过免疫组化分析发现，PD-L1+的患者起效率为27%，PD-L1-患者的起效率为20%，可见MPDL3280A的起效并没有特异性。一项更加深入的包含多项肿瘤的MPDL3280A临床药物试验发现，相比较肿瘤细胞的PD-L1，肿瘤浸润淋巴细胞的PD-L1表达与疗效有更强的相关性[28]。同时，该研究还检查了包括CTLA-4、TH1、CX3CL-1等多个基因位点产物，所有结果都指向一点共识，就是通过对治疗前抗肿瘤免疫细胞的相关位点分析，将有希望克服肿瘤的免疫逃逸。

3 OX40

OX40是肿瘤坏死因子超家族（Tumor Necrosis Factor Receptors，TNFR）的一种，作为一种免疫协同刺激分子，只在淋巴组织表达，且主要表达于激活的CD4+和CD8+T细胞[29]。在涵盖黑色素瘤在内的固体肿瘤内的浸润免疫细胞中发现有OX40的表达[30]。实验研究发现，通过注射OX40激动剂，包括B16黑色素瘤小鼠在内的多种肿瘤诱导小鼠都出现治疗效果[31]。

一项包含黑色素瘤在内的含30例患者的Ⅰ期临床试验，使用0.1 mg/Kg、0.4 mg/Kg和2 mg/Kg三种剂量的鼠抗人OX40激动剂，30例患者中有12例出现了包含至少一个肿瘤结节的瘤体萎缩，包括黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、胆管癌和尿道鳞状细胞癌。试验患者均未发生严重的毒副作用，轻度的疲劳和淋巴细胞减少是主要的副作用，在停药72 h内得到缓解[32]。

44 -1BB

另一种重要的T细胞协同刺激通路是4-1BB，原称CD137，同样也属于肿瘤坏死因子超家族。4-1BB被激活后通过诱导Bcl2和BCL-x1来减少T细胞的凋亡[33]。在4-1BB激动剂注射后，能发现肿瘤杀伤T细胞细胞毒性以及自然杀伤细胞活性的增强，同时可观察到CD8+T细胞介导的抗肿瘤反应，包括分泌干扰素γ，产生对肿瘤抗原的长期免疫记忆[34]。4-1BB同样可见于肿瘤内皮细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和造血细胞。内皮细胞上表达的4-1BB通过与细胞间黏附因子1（IntercelluarAdhesion Molecule-1，ICAM-1）和血管黏附分子1（Vascular Adhesion Molecule-1，VCAM-1）的协同作用促进T细胞渗透入肿瘤[35]。临床使用的抗4-1BB激动剂虽然未见报道，但是相信不久之后将会出现此类的药物试验。

5 小结

综上所述，越来越多针对T细胞的抗肿瘤药物被FDA批准用于黑色素瘤的临床药物试验，相信这将会给中晚期的黑素瘤患者带来新的治疗方案。黑色素瘤的抗体治疗仍有很多未解决的问题，如参加药物试验的患者极少被治愈；如何将药物联合运用；免疫药物的安全性等。但是，这将是研究肿瘤与免疫之间的关系的一个良好机会，有望为黑色素瘤患者带来新的希望。

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Research Progress of Antibody Therapy in Melanoma

ZHAO Hui,SUN Mengyan,WANG Yuchong,XUE Chunyu.Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China. Corresponding author:XUE Chunyu(E-mail:xcyfun@sina.com).

Malignant melanoma;Monoclonal antibody;Costimulatory factor

R622

B

1673－0364（2016）06－0381－04

2016年4月22日；

2016年6月4日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.015

上海市科学技术委员会科研计划项目（13JC1401403）；第二军医大学青年启动基金课题（2013QN08）。

200433上海市第二军医大学附属长海医院整形外科。

薛春雨（E-mail：xcyfun@sina.com）。

【Summary】Malignant melanoma is a kind of highly malignant tumor originated from neural crest melanin cells,prone to distant metastases,the prognosis of patients with metastatic malignant melanoma is poor.Immunotherapy in recent years gradually becomes the new direction for treating malignant melanoma,a growing number of immune drugs are used in clinical treatment.There has been a revolution in the clinical management of melanoma with the development of multiple antibodies that influence T cell regulatory pathways,including checkpoint inhibition and co-stimulation.In this paper,two monoclonal antibodies(PD-1 and CTLA-4),and two costimulatory pathways(OX40 and 4-1BB)were reviewed to describe the recent progress for treating melanoma.