超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记干细胞的研究进展

张昕桐 综述 熊 猛 审校

超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记干细胞的研究进展

张昕桐 综述 熊 猛 审校

超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）是一种在细胞标记、药物靶向投递、肿瘤热治疗等领域，都有着广泛应用前景的纳米材料。再生医学研究中，干细胞的研究和应用广受关注，SPIONs的出现为干细胞的标记和示踪提供了新的途径。SPIONs具有超顺磁性、低毒性、良好生物相容性，以及在外加磁场下定向移动等特点。SPIONs在MRI成像上表现为信号减弱区域，经过表面修饰后可有效、安全地标记干细胞，但同时也存在细胞毒性不明确和MRI成像限制性等问题。本文就超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记干细胞的研究进展进行综述。

超顺磁性氧化铁干细胞标记

随着再生医学的不断发展，干细胞的研究和应用广受关注。干细胞是一类具有良好增殖能力和多向分化潜能的细胞，这种特性使干细胞能够在受损的器官、组织发挥其修复作用。为了更好地研究干细胞的治疗机制及评估干细胞的修复作用，需要一种安全有效的细胞标记技术。目前，通过磁对比剂标记细胞进行MRI成像，已成为一种细胞定位的重要检测手段。MRI成像具有非侵害性、高精确性等特点，在使用磁对比剂时能提供精确的图像分析。在磁对比剂的选择上，超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs）成为较为瞩目的选择，其在MRI成像中的作用已经在大量研究中得到证实。本文就SPIONs标记干细胞的研究进展进行综述。

1 SPIONs

SPIONs是一种具有超顺磁性的氧化铁纳米颗粒，这类材料只在外部磁场的作用下才表现出磁性[1]。在MRI成像时，SPIONs在相应区域展现出磁性，当去掉外部磁场时，SPIONs的磁性也会消失。SPIONs的这种受外部磁场影响的磁性特点，在细胞标记方面有着良好的应用。其中，磁性Fe3O4最具有应用前景。SPIONs具有超顺磁性、低毒性、良好生物相容性，以及在外加磁场下定向移动等特点[2]。这些纳米颗粒在细胞标记、药物靶向投递、肿瘤热治疗等方面，都具备广泛的应用前景[3]。利用SPIONs的磁性特点，与MRI成像相结合，以标记和示踪细胞，已成为一种有效的细胞定位方法。

2 SPIONs的MRI成像

SPIONs超顺磁性的特点使其成为一种MRI成像高度敏感的对比剂，且较少产生副作用。当有SPIONs存在时会干扰固有的磁场均匀性，使得铁颗粒所在部位与周围组织产生不同的磁场敏感性，造成周围质子的快速移相，导致在T2和T1成像的弛豫时间减低。SPIONs作为T2磁对比剂主要作用是改变MRI的R2驰豫，缩短T2时间，减弱T2加权信号。其特点是粒径在纳米范围内，穿透力强，弛豫率为等浓度Gd3+的7～10倍，能在很低浓度下引起MRI成像，表现为信号减低区域，能与周围组织形成对比[4]。SPIONs和其他磁对比剂相比，有可降解性、体内留存时间长及低毒性的特点。磁性纳米粒子由氧化铁颗粒、生物相容性外衣、间隔臂及活性分子构成。核心颗粒大小及表面修饰均会影响SPIONs的磁性特点[5]。

3 SPIONs标记干细胞

SPIONs具有低毒性、可降解性、可监测性、有一定的维持时间和排出途径的特点。SPIONs粒径1～100 nm[6]，不易被网状内皮系统非特异性吞噬。SPIONs表面带有正电荷，常需表面修饰，未经表面修饰的SPIONs不稳定，易在液态环境中聚合。

SPIONs标记干细胞的机制主要有两种方式，一种是将纳米颗粒依附于细胞表面；另一种是细胞将纳米颗粒内在化，主要包括直接胞吞作用、受体介导的胞吞作用及转染剂介导的胞吞作用[7]。体内实验中，第一种方式有着明显的限制性，网状内皮系统会识别并清除这些SPIONs标记的细胞。而通过内在化途径，SPIONs能存留在干细胞的细胞质中，并具有良好的生物相容性。目前，增强SPIONs跨膜的方法有外加电磁场使SPIONs向照射部位靶向聚集；在SPIONs表面修饰能与靶细胞膜上受体结合的配体，使得SPIONs与靶细胞特异性结合；促进单核-吞噬细胞吞噬SPIONs，促进被动转运。细胞的标记率与SPIONs浓度呈正相关，SPIONs浓度越高，细胞标记率越高，但过高的SPIONs浓度会导致细胞内铁含量过多，影响细胞生物学活性及增殖能力。SPIONs标记细胞的有效安全浓度为20～50 mg/L[8]，以适当浓度标记干细胞，不会对其生物学活性、增殖能力及多向分化能力产生明显影响。

4 SPIONs的表面修饰

由于未经表面修饰的SPIONs不稳定，同时为了提高其细胞标记率，需要对SPIONs进行表面修饰[9]。正确的表面修饰可以提高SPIONs的稳定性、水溶性和生物相容性，防止其聚合，还能加强SPIONs与药物、抗体等物质的结合。标记细胞时常会用到转染剂，如多聚赖氨酸、硫酸盐和鱼精蛋白等。通过转染剂，SPIONs能更快、更准确地标记细胞。在选择正确的表面修饰的同时，需注意选择合适的转染剂。有研究尝试在SPIONs表面包被不同的物质，如柠檬酸、葡聚糖、甘露糖、聚乳酸、聚乙烯亚胺等。不同的表面修饰会对SPIONs的理化性质产生不同的影响[10]。需要根据SPIONs的具体用途和研究目的选择正确的表面修饰。

5 SPIONs的实验研究

目前，有大量实验研究通过SPIONs标记各种干细胞对不同的动物模型进行体内实验。

Scharf等[11]将SPIONs和荧光蛋白双重标记骨髓间充质干细胞,并移植入肌腱损伤的大型动物模型体内，证明SPIONs标记细胞是在大型动物体内示踪细胞的有效途径。实验结果表明，以浓度为25 μg/mL或50 μg/mL的SPIONs标记细胞时，细胞活性不受明显影响，而以浓度为100 μg/mL的SPIONs标记时，细胞活性略有降低。骨髓间充质干细胞的标记率在以25 μg/mL和50 μg/mL浓度的SPIONs处理时是95%和94%。SPIONs的代谢活动和增殖能力与未标记的细胞无明显差异。干细胞分化能力方面，标记的细胞和未处理的细胞的成骨和成脂分化能力无显著差异，而成软骨分化能力明显降低。MRI成像方面，在深屈肌腱的背平面MRI图像上，可见在注射部位的第7天和第14天出现球形信号缺失和集中区域信号缺失。

孟增东等[12]采用不同浓度SPIONs（12.5、25、50、100 mg/L）联合多聚赖氨酸（0.75 mg/L），标记兔骨髓间充质干细胞。实验发现，25 mg/L的SPIONs联合0.75 mg/L的多聚赖氨酸标记兔骨髓间充质干细胞具有较高的安全性和有效性，对细胞活性没有影响，且不影响干细胞的成骨、成脂分化能力。MRI扫描能明显有效地显像SPIONs标记细胞。

Parsa等[13]以SPIONs标记大鼠胚胎干细胞发现，SPIONs对胚胎干细胞的自我复制能力没有影响，倒置显微镜观察和普鲁士染色显示细胞标记率为100%，SPIONs标记的胚胎干细胞的细胞活性和分化能力没有变化，同时通过表型分析发现胚胎干细胞的SSEA1和CD117没有改变。

麦筱莉等[14]用多聚左旋赖氨酸和SPIONs的复合物体外标记骨髓源性内皮祖细胞，并观察标记细胞移植至小鼠缺血性脑梗死模型后的迁移情况。MRI观察标记细胞的迁移情况，普鲁士染色检测EPC的分布情况。结果显示，标记细胞脑内移植后1周，MRI显示移植区低信号改变，并沿胼胝体向病灶侧迁移，而普鲁士染色显示部分移植的标记细胞沿胼胝体向损伤侧迁移，证明多聚左旋赖氨酸和SPIONs复合体能够在体内评价细胞移植后的脑内迁移。

Kim等[15]用SPIONs标记了间充质干细胞、神经干细胞和造血干细胞。将SPIONs标记细胞注入乳鼠胶质瘤模型当中，在注射后第10天MRI观察到向肿瘤组织迁移的干细胞，并通过组织学（普鲁士染色等）确认了肿瘤组织当中的注射细胞。实验表明SPIONs没有细胞毒性，被标记干细胞的细胞活性、增殖能力和分化能力未受影响。

6 SPIONs的局限性

SPIONs作为一种细胞标记的新途径存在其局限性。首先，SPIONs是否存在细胞毒性仍然存在争议，也是限制其应用的主要原因。尽管大量的实验研究表明，SPIONs标记细胞后不会对细胞活性、增殖能力及分化能力造成明显影响。但有部分研究指出，由于SPIONs是由可降解铁合成的，当铁被细胞吸收时会产生铁催化活性氧[16]。Costa等[17]指出，部分SPIONs会对神经元细胞、胶质细胞产生细胞毒性。也有研究指出，细胞毒性是由转染剂造成，会对干细胞分化能力产生影响。因此，SPIONs的细胞毒性还需进一步的研究证实。

其次，SPIONs的MRI成像也有其限制性。随着细胞的有丝分裂，SPIONs的图像会不断减弱甚至消失。当细胞在体内迁移时，SPIONs的MRI成像敏感性也会降低[18]。当细胞死亡时，SPIONs仍会存在于体内并产生相应的图像，会对细胞示踪产生错误的引导。因此，SPIONs的MRI成像还有许多问题亟待研究解决。

7 小结

SPIONs作为一种新的细胞标记途径，具有超顺磁性、低毒性、良好生物相容性，以及在外加磁场下定向移动等特点，是一种能与MRI成像相结合的标记和示踪细胞的有效方法。SPIONs在MRI成像上表现为信号减低区域，能与周围组织形成对比。经过表面修饰的SPIONs与干细胞能够安全、有效地结合，能保持较高的细胞标记率，不会对细胞的生物学活性、增殖能力及多向分化能力产生明显影响。但SPIONs存在其应用的局限性，多数实验研究仅处在体外实验及动物研究中，其细胞毒性的不确定性和MRI成像的限制性尚待解决。尽管如此，SPIONs作为一种新的细胞标记途径仍具有远大前景，需要大量的研究将其推向临床实验阶段。相信随着干细胞标记技术和分子影像学的不断发展，SPIONs能在再生医学领域发挥不可估量的作用。

[1]LaConte L,Nitin N,Bao G,et al.Magnetic nanoparticle probes [J].Mater Today,2005,8(5):32-38.

[2]Bull E,Madani SY,Sheth R,et al.Stem cell tracking using iron oxide nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2014,9:1641-1653.

[3]宋新峰,孙汉文,吴静,等.超顺磁性纳米粒子化学合成及生物医学应用进展[J].应用化工,2014,44(4):711-719.

[4]Urdzíková L,Jendelová P,Glogarová K,et al.Transplantation of bone marrow stem cells as well as mobilization by granulocytecolony stimulating factor promotes recovery after spinal cord injury in rats[J].J Neurotrauma,2006,23(9):1379-1391.

[5]Rogers WJ,Basu P.Factors regulating macrophage endocytosis of nanoparticles:implicationsfortargetedmagneticresonance plaque imaging[J].Atherosclerosis,2005,178(1):67-73.

[6]Alam S,Anand C,Ariga K,et al.Unusual magnetic properties of size-controlled iron oxide nanoparticles grown in a nanoporous matrix with tunable pores[J].Angew Chem Int Ed Engl,2009,48 (40):7358-7361.

[7]Nucci LP,Silva HR,Giampaoli V,et al.Stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles in a preclinical model of cerebral ischemia:a systematic review with meta-analysis[J]. Stem Cell Res Ther,2015,6:27.

[8]Ko IK,Song HT,Cho EJ,et al.In vivo MR imaging of tissueengineered human mesenchymal stem cells transplanted to mouse: a preliminary study[J].Ann Biomed Eng,2007,35(1):101-108.

[9]陈鹏,张杰,荣冬明,等.无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒影响骨髓间充质干细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2014,18 (16):2526-2531.

[10]王瑞,庞希宁,施萍,等.聚乙烯亚胺包被的四氧化三铁磁纳米颗粒对hAMSCs生物特性的影响[J].基础医学与临床,2013,33 (11):1382-1386.

[11]Scharf A,Holmes S,Thoresen M,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a means to track mesenchymal stem cells in a large animal model of tendon injury[J].Contrast Media Mol Imaging,2015,10(5):388-397.

[12]孟增东,邱伟,胡彪,等.超顺磁性氧化铁纳米颗粒体外标记兔骨髓间充质干细胞的安全性以及MRI成像特征[J].中国组织工程研究,2012,16(6):951-957.

[13]Parsa H,Shamsasenjan K,Movassaghpour A,et al.Effect of superparamagnetic iron oxide nanoparticles-labeling on mouse embryonic stem cells[J].Cell J,2015,17(2):221-230.

[14]麦筱莉,韩冰,范海健,等.体外标记内皮祖细胞小鼠缺血性脑梗死模型局部移植后向病灶侧迁移的MRI实验研究[J].医学影像学,2015,25(1):143-147.

[15]Kim SJ,Lewis B,Steiner MS,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticles for direct labeling of stem cells and in vivo MRI tracking[J].Contrast Media Mol Imaging,2016,11(1):55-64.

[16]Hoepken HH,Korten T,Robinson SR,et al.Iron accumulation, iron-mediated toxicity and altered levels of ferritin and transferrin receptor in cultured astrocytes during incubation with ferric ammonium citrate[J].J Neurochem,2004,88(5):1194-1202.

[17]Costa C,Brandäo F,Bessa MJ,et al.In vitro cytotoxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles on neuronal and glial cells.Evaluation of nanoparticle interference with viability tests [J].J Appl Toxicol,2016,36(3):361-372.

[18]Guzman R,Uchida N,Bliss TM,et al.Long-term monitoring of transplanted human neural stem cells in developmental and pathological contexts with MRI[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(24):10211-10216.

Research Progress of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles on Labeling Stem Cells

ZHANG Xintong,XIONG Meng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhongda Hospital,Southeast University.Corresponding author:XIONG Meng(E-mail:bearbrave@sina.com).

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles;Stem cells;Labeling

Q813.1+1

B

1673－0364（2016）06－0378－03

2016年7月24日；

2016年10月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.014

210009江苏省南京市东南大学附属中大医院烧伤整形科。

熊猛（E-mail：bearbrave@sina.com）。

【Summary】Superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPIONs)are a kind of nano materials which have broad application prospects in the field of labeling cells,targeted drug delivery and heat treatment of tumor.Especially in regenerative medicine,more and more research and application of stem cells have been founded.SPIONs have provided a new method to label and track cells.The characteristics of SPIONs are superparamagnetic,low toxicity,good biocompatibility and directional movement in the magnetic field.SPIONs present low signal area in magnetic resonance imaging(MRI)and they can label cells safely and effectively with appropriate coatings.But the uncertainty of cytotoxicity and the limitation of MRI are still unsolved.In this paper,the research progress of SPIONs in labeling cells were reviewed.