内质网应激参与动脉粥样硬化机制的研究进展

周昌钻+季政++孟立平++郭航远

[关键词] 内质网应激；动脉粥样硬化；细胞凋亡；细胞自噬；炎症反应

中图分类号：R543.3；R363.2 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2015）06-0482-04

doi.10.3969/j.issn.1009-816x.2015.06.16

内质网是一种存在于真核细胞中并与核膜、高尔基体、细胞膜相互连续，参与分泌蛋白、膜蛋白折叠及Ca2+水平调节的复杂膜性结构。内质网发挥折叠功能需分子伴侣参与，如葡萄糖调节蛋白78kDa （glucoseregulated protein 78kDa，GRP78）、钙连蛋白、钙网蛋白帮助新生多肽正确折叠，糖基化修饰酶类（寡糖转移酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶）进行糖化修饰。此外，内质网腔内氧化还原状态和高钙环境也是其发挥功能所必须的。内质网对内外环境变化敏感，可受高糖、缺氧、药物、血流剪切力等因素干扰，影响其蛋白质折叠功能，即内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS主要激活三条信号通路：未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），内质网超负荷反应和固醇调节级联反应。目前对ERS信号通路的研究主要集中在UPR信号通路。

研究显示ERS参与了心血管疾病、肿瘤、神经退行性疾病、肾脏疾病、肝脏疾病等的发生与发展。ERS作为一种重要机制参与多种疾病的调节，但其具体作用方式仍不明确。本文重点就内质网应激参与动脉粥样硬化这一病理生理过程的调节机制做一论述。

1 ERS

ERS刺激细胞产生保护性的UPR反应。由轻微的、短暂的环境变化引起的ERS可被UPR反应迅速纠正，避免机体的损伤。而明显的病理环境下引起的ERS常持续而强烈，超过UPR的纠正能力，进一步激活UPR下游的损伤性信号通路，导致细胞损伤甚至最终诱导细胞死亡。UPR信号通路包括蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER kinase，PERK）信号通路、肌醇需求酶1 （inositol-requiting enzyme 1，IREl）信号通路、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）信号通路。三种ERS感受器同属于内质网膜蛋白，一般情况下与GRP78结合并处于无活性状态。内质网未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网控的积聚可诱导GRP78与三者解离，并促使三种膜蛋白磷酸化激活，启动下游信号通路。信号通路从促进蛋白质折叠、抑制蛋白质翻译、降解错误折叠蛋白质三方面减轻内质网负荷。研究发现，其他改变应激感受器分子构象的因素，如内质网腔ATP、Ca2+及氧化还原水平的改变或者应激感受协同因子Erdj5，都可通过影响其与GRP78的连接，诱发ERS。

1.1 PERK-CHOP信号通路：PERK腔内端与GRP78解离后暴露磷酸化位点并被激活。激活的PERK受体可磷酸化真核细胞翻译起始因子2（eukaryotic trans-lation initiation factor 2，eIF2）a亚基，抑制其征集Met-tRNA和40S核糖体亚单位的能力，最终影响大多数蛋白质的翻译。但是，UPR信号通路中的多种信号通路蛋白，如ATF4却可逃避这种机制的影响，在细胞内继续翻译表达。ATF4可作为转录因子进入细胞核，结合于UPR相关基因启动子的ERS反应元件（ER stress response element，ERSE），上调CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CAAT/enhancer-binding protein ho-mologous protein， CHOP）及生长抑制与DNA损伤诱导基因34 （growth arrest and DNA-damage-inducible gene34，GADD34）的表达。GADD34可去磷酸化eIF2a-P，恢复eIF2a正确活性，防止蛋白表达抑制过度导致的细胞死亡。CHOP与其同源蛋白结成稳定的二聚体，作为转录因子调节目的基因表达，一方面抑制抑凋亡基因Bcl-2、Bnip3表达，另一方面使凋亡基因，如GADD34、Bim上调，最终导致细胞凋亡。CHOP除受PERK调节外，也受到IRE1和ATF6信号通路的调节，但不作为主要调节机制。

1.2 IREl-XBP1信号通路：IRE1与GRP78解离后，在空间上相互接近并发生自体磷酸化。P-IREla具有核酸内切酶活性，从X盒结合蛋白1（X-box binding protein-l，XBP-1） mRNA中特异性剪切出26个碱基的内含子，改变XBP-1 mRNA开放阅读框，最终翻译出有活性的XBP1蛋白。XBP1蛋白进入细胞核，结合于ERSE，既可上调ERS相关降解（endoplasmic reticu-lum-associated degradation，ERAD）的相关蛋白如GRP78的表达，也可影响脂质代谢进程。此外，研究发现IRE1可根据mRNA编码序列，选择性降解引起ERS蛋白的mRNA，在翻译水平减少蛋白质产生，缓解ERS。

1.3 ATF6信号通路：ATF6作为内质网Ⅱ型跨膜蛋白，在ERS中转移至高尔基体，随即被位点蛋白酶1（site protease 1，SPl）和SP2裂解，产生bZIP转录因子ATF6（P50）。随后该片段进入细胞核，结合于ERSE，激活CHOP. XBP1等ERAD相关蛋白的表达。经典的UPR反应可激活三条信号通路，但研究发现UPR信号通路也具有组织特异性，如ERS诱导物诱导B淋巴细胞分化时，只发现IRE1和ATF6通路激活。

2 ERS参与动脉粥样硬化的机制

ERS存在于动脉粥样硬化的各个时期，且长期的ERS被视为促动脉粥样硬化的关键因素。

2.1 ERS与细胞凋亡：细胞凋亡与动脉粥样斑块的破裂密切相关。检测动脉粥样斑块发现血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞都存在明显的细胞凋亡。在动脉粥样硬化后期，巨噬细胞及泡沫细胞凋亡释放大量脂质、溶酶体酶和自由基，并增加斑块坏死核心的体积，损伤血管内皮细胞和平滑肌细胞，进一步加重局部炎症反应。内皮细胞凋亡破坏了血管内皮完整性，致内皮下的胶原暴露，引起血小板聚焦和附壁血栓的形成，促进oxLDL渗入粥样斑块，增加粥样斑块破裂的可能。此外，纤维帽部分的血管平滑肌细胞凋亡可影响胶原纤维分泌，致使粥样斑块的帽状结构更加薄弱，促使斑块向不稳定斑块发展。endprint

细胞凋亡由两条相互关联的信号瀑布调控：内在的线粒体途径以及外在的死亡受体（death receptor，DR）途径。ERS对两条信号通路都存在调节作用。研究发现，短暂的ERS可激活IREla的核酸酶活性，介导IREla依赖的衰退（IREla-dependent decay，RIDD），通过水解DR5的mRNA，抑制DR5介导的细胞凋亡持续的应激则导致IREla核酸酶活性逐渐下降，DR5 mRNA转录与降解间的平衡向促凋亡侧倾斜，最终诱导细胞进入凋亡程序。此外，ERS还可通过CHOP蛋白影响细胞调亡。ERS激活的UPR三条信号通路（PERK-eIF2a，IREl-XBP1和ATF6）诱导转录因子CHOP，上调促凋亡分子GADD34、Bax、Bak、Bim，下调抑凋亡分子Bc12。CHOP蛋白可干扰内质网上的钙释放通道，引起内质网过度释放，启动细胞凋亡程序。若ERS持续状态未得到改善，则进入最后的细胞凋亡程序。ERS在细胞调亡中的作用随着研究的深入已逐渐清晰，控制动脉粥样硬化斑块的ERS可能是治疗动脉粥样硬化的一个新的策略。

2.2 ERS与细胞自噬：细胞自噬是细胞在某些生理或病理因素刺激下，损伤的细胞器和无功能蛋白被来源于内质网的双层膜性小泡包裹，后与溶酶体融合，并被降解、回收利用的一种病理生理过程。Ox-LDL可抑制血管皮内细胞的细胞自噬，诱导细胞凋亡的发生，破坏血管内膜完整性。有研究发现，用脂联素促进动脉粥样斑块内巨噬细胞的细胞自噬可稳定斑块，抑制斑块进展。此外，增强血管平滑肌细胞的细胞自噬可有效地抑制平滑肌细胞向泡沫细胞的转变。ERS可激活细胞自噬一溶酶体系统参与损伤细胞器和无功能蛋白的降解，并被视为Ⅱ型ERAD，可作为ERAD的补充和替代。研究发现在动脉粥样硬化斑块内，多种自噬蛋白，如Beclins、自噬蛋白5（autophagy protein 5，ATG5）等表达上调。ERS诱导的细胞自噬可通过称为“噬脂”的过程，水解细胞吞噬的脂肪滴，介导胆固醇向胞外的载脂蛋白AI转运，调节细胞胆固醇的代谢和外流，减轻泡沫细胞脂质负荷。若抑制细胞自噬，如敲除ATG5，则可检测到主动脉全段泡沫细胞数量和斑块面积的显著增加。

ERS既能增强细胞自噬也可抑制细胞自噬。研究发现，UPR下游中的ATF4、CHOP，可诱导多种ATG家族成员的表达；IREa信号通路可促进自噬小泡的形成。若通过敲除ATG16L1基因抑制细胞自噬，则UPR相关分子如GRP78、eIF2a-P、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、IRE1表达水平显著升高。可见ERS与细胞自噬存在相互作用的关系。此外，ERO的下游通路也存在抑制细胞自噬发生的机制。在多种细胞中验证发现，若敲除ERAD过程的脚手架蛋白一同型半胱氨酸诱导的内质网应激蛋白（homocysteine-inducible ER stress protein， Herp），可检测到细胞自噬调节蛋白Beclinl和ATG5水平的显著升高，以及细胞在应激下更强的存活能力。动物实验也提示Herp敲除能增加主动脉血管细胞自噬水平，显著延缓斑块进展。ERS对细胞自噬的双重作用的生理意义，如何利用细胞自噬保护性作用的同时选择性的抑制ERS下游中抑细胞自噬信号通路，可能在动脉粥样硬化治疗方面具有重要的价值。

2.3 ERS和炎症反应.动脉粥样硬化目前被普遍接受是一种慢性炎症反应过程。动脉斑块区域可检测到多种趋化因子高表达，并且这些趋化因子诱导单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞进一步聚集，加剧炎症反应，影响斑块稳定性。ERS在循环系统和非循环系统疾病中都与炎症反应密切相关。Wang YI等观察到血管内皮细胞的ERS水平与血管细胞粘附因子呈正相关。Shinozaki等发现，作为UPR脚手架蛋白的Herp，可能作为炎症诱导因子参与粥样斑块的形成，诱导单核细胞趋化因子1（mono-cyte chemotactic protein 1，MCPl）、TNF-a、IL-6在斑块区域血管的表达。研究发现ERS下游分子ATF4在内皮细胞中可诱导MCP-1的表达，并磷酸化激活炎症因子KB（nuclear factor-KB，NF-KB）和JNK[18]。此外，PERK通路中的P-eIF2a，可抑制包括NF-KB抑制物inhibitor-KB （kB）在内的大多数蛋白质的翻译，从而增加NF-jcB的活性[19]。Nakajima等用亚麻酶细胞毒素模拟ERS中GRP78解离过程，发现细胞通过Akt-ATF6-NF-KB信号通路激活炎症反应瀑布。近期研究发现，激活的IREa信号通路可征集肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2），并形成复合体，一方面激活下游分子NF-KB，另一方面启动IKB的磷酸化降解途径。同样，已经有越来越多的研究证实通过药物干预ERS或者抑制某些UPR信号，可有效抑制血管细胞的炎症反应。

2.4 ERS与线粒体Ca2+稳态失衡：内质网和线粒体间存在天然的联系，线粒体膜表面有约5%～20%的面积与内质网存在连接，此部分内质网膜称为线粒体连接的内质网膜（mitochondria-associated ER mem-branes，MAM）。MAM作为多种信号通路传递的平台，对线粒体融合、线粒体钙负荷、线粒体呼吸等生理活动都有重要调节作用。MAM结构的稳定由两者膜上的内质网线粒体融合蛋白二聚体和BiP与内质网膜sigma-1受体间的连接维持。这些MAM位点有相当高浓度的Ca2+，并通过线粒体Ca2+单向转运体转运进线粒体，参与Ca2+在内质网和线粒体间的快速流动。

目前，实验中常用毒胡萝卜素抑制内质网Ca2+-ATP酶，模拟ERS状态下内质网Ca2+水平失调，构建细胞ERS模型。细胞ERS时常伴有Ca2+通道分子构象改变和1，4，5一三磷酸肌醇受体激活，随后释放内质网内Ca2+入胞浆。升高的胞浆Ca2+通过线粒体Ca2+单向转运体进入线粒体。短期的线粒体Ca2+转运可减轻内质网Ca2+超载，维持其正常功能，而长期转运则会引起线粒体内稳态失衡，干扰线粒体能量代谢。导致能量障碍，进一步抑制了内质网Ca2+-ATP酶摄取胞浆Ca2+能力，加重细胞Ca2+稳态失衡，激活线粒体凋亡通路。Munoz等研究发现PERK在MAMs的Ca2+转运功能的维持具有重要作用，提示ERS时PERK表达的上调可能加速了线粒体Ca2+超载的进程。ApoE-/-鼠体内维持细胞内Ca2+稳定，也发现可保护血管内膜的完整性，并能抑制动脉粥样硬化斑块的恶化。

3 小结

ERS在疾病发生发展中的作用重要且广泛，尤其是动脉粥样硬化这种慢性疾病。动脉粥样硬化的转归由保护性反应（细胞自噬）和损伤性反应（细胞凋亡、炎症反应、能量代谢紊乱）共同决定。ERS可诱导细胞一系列信号通路的激活，并决定细胞不同的命运。短暂的ERS反应可被UPR迅速纠正，并短时间内增强细胞对应激的抵抗能力，而持久或剧烈的ERS无法被细胞自身调节机制纠正，进一步加剧细胞功能紊乱，最终引导细胞走向死亡。ERS并不总扮演损伤性角色在心肌缺血前诱导ERS可增加心肌细胞在缺血中的存活率；在动脉粥样硬化早期，ERS诱导的泡沫细胞凋亡可抑制斑块面积扩大。ERS对细胞功能影响较为广泛，如何通过精确的信号通路抑制或诱导ERS，以及调节下游保护性和损伤性反应间的平衡已成为治疗动脉粥样硬化相关疾病的重要研究热点。但是目前我们对ERS机制的了解还不完善，仍有待于对ERS信号通路更深层次的研究。endprint