HLPC法测定感冒止咳颗粒中葛根素的含量

HLPC法测定感冒止咳颗粒中葛根素的含量

李媛，李强

(东营市食品药品检验中心，山东 东营 257091)

摘要：目的采用高效液相色谱法测定感冒止咳颗粒中葛根素的含量。方法Agilent Eclipse XDB-C18柱 ( 4.6 mm×200 mm，5 μm)；以甲醇-水溶液(28∶72) 为流动相；检测波长为250 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温：35 ℃。理论板数按葛根素峰计算应不低于4 000。 结果 葛根素与其相邻杂质峰能完全分离，葛根素进样量在0.088 22~0.441 1 μg 之间与峰面积呈良好的线性关系，相关系数R2=1.000 0，平均加样回收率为97.66%，RSD=0.8017%(n=6)。结论 本方法操作简便，精密度好，结果准确可靠，可用于感冒止咳颗粒的质量控制。

关键词：感冒止咳颗粒；葛根素；含量测定；高效液相色谱法

作者简介：李媛，女，研究方向：中药学，E-mail:licc22@163.com

中图分类号：R927.2文献标识码：A

Determination of puerarin in Ganmao Zhike Granules by HPLC

LIYuan,LIQiang

(DongyingCenterforFoodandDrugControl,Dongying257091,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of puerarin in Ganmao Zhike Granules by HPLC.MethodsThe C18 column (4.6 mm× 200 mm，5 μm) was adopted with the mobile phase of methanol-water(28∶72)at the flow rate o f 1.0 mL·min-1，and the detection wavelength was 250 nm.Theoretical plate number should not be less than 4 000 according to the puerarin peak.ResultsThe date showed that this method could clearly separate puerarin peak from its nearby impurity peaks，with a better linear range of 0.008 82~ 0.441 1 μg(R2=1.000 0)，and the average recovery was 97.66% and the RSD was 0.801 7% (n=6).ConclusionThis method was simple，accurate and reliable，so it can be used for the quality control of Ganmao Zhike Granules.

Key words:Ganmao Zhike Granules;Puerarin;Determination;HPLC

感冒止咳颗粒处方来源于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第二册收载的感冒止咳冲剂(WB3-B-0446-90)，是由柴胡、金银花、黄芩、连翘、葛根、青蒿、苦杏仁、桔梗、薄荷脑组成。辅料为蔗糖的中药成方制剂。感冒止咳颗粒用于治疗感冒发热引起的头痛、鼻塞、伤风、咳嗽、咽喉肿痛、四肢怠倦等症。药品中葛根用量较大，而葛根中主要含异黄酮成分葛根素、葛根素木糖苷等成分。其中的葛根素具有可有效逆转化学诱导的肝纤维化，增强心肌收缩力，扩张血管、改善微循环，保护红细胞的变形能力，增强造血系统功能，具有抗血小板聚集，增加纤溶活性，降低血粘度作用，对非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫有明显的调节作用，可促进正常人和肿瘤病人的淋巴细胞转化率，增强自然素作用，对干扰系统有明显的刺激和诱生作用[1~4,8]。

感冒止咳颗粒质量标准简单，仅有连翘、葛根素、绿原酸鉴别项和黄芩苷的含量测定项[2]，因药品中葛根药效大、用量较大、文献资料较少，故本实验以葛根素为指标，采用高效液相色谱法测定含量，以控制感冒止咳颗粒的质量，以保证病人用药的有效性。

1实验部分

1.1仪器Agilent 1200 series 高效液相色谱系统，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；KQ-50B型超声清洗器；Mettler Toledo电子天平。

1.2试药葛根素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110752-200912，供含量测定使用，以96.0%计)；甲醇为色谱纯，水为去离子纯化水，其余试剂为分析纯；感冒止咳颗粒(生产厂家：太极特格尔，批号：13020005B、13020013B、13030002B、13030015B、13050007B；云南白药，批号：ZAB1302、ZAB1309、ZAB1311、ZAB1333、ZAB1342；北京同仁堂，批号：2112006、2112017、2113011、2114004、2114016)。

2方法和结果

2.1色谱条件色谱柱：Eclipse-XDB-C18柱(4.6×200 mm，5 μm)；流动相:甲醇-水(28∶72)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长[5]：250 nm；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。理论板数按葛根素峰计算应不低于4 000。

2.2对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的葛根素对照品0.014 36 g，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取此贮备液2.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度为44.11 μg·mL-1的对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备3种样品，每种样品5个批号，各取约10 g，研细。精密称取约1 g，置于50 mL容量瓶中，精密加入甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，用甲醇定容到刻度，过滤，弃去初滤液，续滤液用孔径0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4阴性样品溶液的制备[6]按处方制备不含葛根素的阴性样品，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液。

2.5系统适应性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图。结果供试品溶液中葛根素能达到基线分离，样品中其他成分对葛根素测定无干扰，理论板数按葛根素峰计算应不低于4 000，见图1~3。

图1　葛根素对照品HPLC色谱图

图2　感冒止咳颗粒HPLC色谱图

图3　感冒止咳颗粒阴性样品HPLC色谱图

2.6线性关系考察精密吸取“2.2”项下的对照品溶液2、4、6、8、10 μL分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积积分值，以葛根素的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y=3 940.2X-7.580 0，R2=1.000 0。结果表明，葛根素进样量在范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.7精密度试验精密吸取葛根素对照品溶液(44.11 μg·mL-1)5 μL,连续进样5次，测定峰面积积分值，结果RSD=0.18%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.8稳定性试验精密吸取供试品溶液5 μL，在0～24 h内进样6次(0、2、4、8、12、24 h),测定峰面积，以考察样品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。结果RSD为1.59%(n=6)，表明供试品在24 h内稳定性良好，能够满足测定需要。

2.9重现性试验取样品(云南白药集团股份有限公司，批号：ZAB1311)平行制备5份供试品溶液，按上述条件和方法进行测定，分别计算含量。结果葛根素的平均含量为2.502 mg·g-1，RSD为0.194 9%。表明该方法重现性良好。

2.10加样回收率试验精密称取已知含量为2.435 mg·g-1的样品(云南白药集团股份有限公司生产)约0.5 g，共6份，加入浓度为44.11 μg·mL-1葛根素对照品溶液30 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定含量并计算回收率，结果葛根素平均回收率为97.66%，RSD为0.801 7%。

2.11样品含量测定取3种感冒止咳颗粒样品(太极特格尔、云南白药、北京同仁堂)，分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，每个批号制备一个供试品溶液，在上述色谱条件下测定并计算葛根素含量，结果见表1。

表1　3种感冒止咳颗粒中葛根素含量测定结果

3讨论

3.1提取溶剂的选择[1,7]笔者比较了95%乙醇、50%乙醇和甲醇3种溶剂在超声时间相同的情况下对样品中葛根素的提取效果，发现以50%乙醇作为溶剂的提取效果稍好。但由于样品中含有一定比例的蔗糖和糊精，因此经50%乙醇超声处理得到的供试品溶液含糖量高、粘度大，如果直接用于液相色谱测定，会严重损害色谱柱，且杂质峰较多；用甲醇提取能有效去除糖及其他杂质，且简化操作步骤，故选用甲醇作为提取溶剂。

3.2提取时间的选择分别对15、20、30、45 min不同提取时间进行考察。结果显示15、20 min提取不完全，而提取30 min和60 min效果相当，故提取方法确定为超声处理30 min。

3.3流动相的选择[1,7]考察了不同溶剂系统[甲醇-0.3%磷酸溶液(25∶75)、甲醇-水(28∶72)、甲醇-水(25∶75)、甲醇-水(30∶70)]。最终结果表明以甲醇-水(28∶72)为流动相时，分离度及峰形较好。

3.4柱温的选择考察了HPLC法柱温对葛根素分离度和峰形的影响，结果表明柱温为35 ℃时，葛根素峰形和分离度最好。

4结论

4.1在进行药物含量测定的探索性研究中，要尝试采用不同的提取方法、提取溶剂、提取时间、流动相等多方面因素综合分析，确定最佳的实验方案。

4.2葛根素在甲醇中溶解，以甲醇超声处理30 min进行提取试验，测得含量最高。换做其他溶剂提取液中含有一定比例的蔗糖和糊精，对色谱柱损坏大。考察提取时间参照文献并通过对不同提取时间的考察，以半小时为宜。

4.3本文测定方法简便易行，结果准确，重现性好，可有效的控制感冒止咳颗粒的质量。

4.4通过测定3家不同厂家生产的各5批感冒止咳颗粒，含量存在一定的差别(太极特格尔：11.458 mg/袋；云南白药：25.122 mg/袋；北京同仁堂：18.774 mg/袋),可能是因为不同厂家的生产工艺不同，并且葛根原料来源不同。根据《中国药典》2010年版(一部)葛根中葛根素含量标准，按干燥品计算，含葛根素(C21H20O9)不得少于2.4%，故计算每袋药品须含葛根素24 mg，根据检测结果只有云南白药集团股份有限公司生产的感冒止咳颗粒符合药典标准。

参考文献：

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