十二指肠空肠旁路术治疗后T2DM大鼠血糖水平及回肠组织中GLUT-1表达观察

·基础研究·

十二指肠空肠旁路术治疗后T2DM大鼠血糖水平及回肠组织中GLUT-1表达观察

冯启凯1，季万胜2，杨洪鸣1，郭瑜1，刘凤娇1，曲梅花1

(1潍坊医学院山东省高校应用药理学重点强化建设实验室，山东潍坊261053；2潍坊医学院附属医院)

摘要：目的观察十二指肠空肠旁路术(DJB)后2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖水平及回肠组织中葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)的表达变化。方法雄性Wistar大鼠36只，随机分为空白组、模型组和手术组。模型组和手术组以腹腔注射链脲佐菌素建立T2DM模型。手术组施行DJB术。分别于术后第1、4、8周(空白组、模型组于同一时间)测大鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平。术后第8周处死大鼠，分别采用免疫荧光双标记法及Western blotting法检查回肠组织中的GLUT-1。结果手术组术后1、4、8周后空腹血糖、空腹胰岛素水平降低，与术前相比，P均<0.01；手术组、空白组术后1、4、8周空腹血糖及空腹胰岛素水平低于模型组(P均<0.01)。手术组、模型组、空白组GLUT-1阳性细胞数分别为(226±7)、(78±5)、(46±4)个，三组两两相比，P均<0.01；手术组、模型组、空白组回肠组织中GLUT-1相对表达量分别为1.642 1±0.213 4、0.723 2±0.126 2、0.315 4±0.075 1，三组两两相比，P均<0.01。结论 DJB术后T2DM大鼠血糖水平降低，回肠组织中GLUT-1表达增高，其降糖作用可能与调节GLUT-1表达有关。

关键词：2型糖尿病；十二指肠空肠旁路术；血糖；葡萄糖转运蛋白1；动物实验

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.008

中图分类号：R587.1文献标志码：A

收稿日期：(2015-07-27)

通信作者：曲梅花

国际糖尿病联盟(IDF)认为减重手术是血糖控制不良尤其伴高血压、血脂异常及肥胖2型糖尿病(T2DM)患者的适宜治疗手段[1，2]。有学者[3，4]评估了减重手术和药物治疗的有效性和安全性，但手术治疗糖尿病的机制一直未明确。葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)是分布最广泛的葡萄糖转运蛋白[5]，可介导葡萄糖在细胞内外的转运。鉴于小肠是葡萄糖吸收的主要部位，2015年2~6月，我们观察了十二指肠空肠旁路术(DJB)治疗后T2DM大鼠血糖水平及回肠组织中GLUT-1的表达变化，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验材料雄性Wistar大鼠36只，SPF级，体质量200~220 g，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供(许可证号SCXK鲁20130001)；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；安稳血糖仪和血糖试纸条购自广东三诺生物传感股份有限公司；GLUT-1酶联免疫检测试剂盒购自美国RD公司；鼠抗人Antihu一抗、兔抗鼠GLUT-1一抗购自美国Milipore公司；驴抗鼠Cy3二抗、山羊抗兔FITC二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；冰冻切片机购自德国LEICA公司；低温冷冻离心机购自美国Sigma公司；奥林巴斯IX71荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；ZEISS全自动图像分析仪购自北京普瑞赛司仪器有限公司。

1.2动物分组及DJB手术方法将大鼠随机分为空白组、模型组、手术组，每组12只。模型组、手术组大鼠禁食12 h，以STZ 53 mg/kg腹腔注射，3 d后鼠尾末端静脉取血，以空腹血糖>13.9 mmol/L且稳定7 d以上判定为T2DM模型制作成功[6]。手术组施行DJB手术：大鼠术前12 h禁食，术前6 h禁水；给予氯胺酮150 mg/kg腹腔注射麻醉；在胃幽门处剪断十二指肠，缝合封闭断端；于屈氏韧带下约10 cm处剪断空肠，空肠远端与幽门部进行吻合，于空肠断端下约7 cm处进行空肠近端吻合；用腹腔大网膜分别包绕上述两个吻合口以防止吻合口漏[7]；术后27 ℃保温，碘伏消毒腹部切口约1周，持续3 d腿部肌注青霉素5万IU防感染，每天2次腰背部两侧皮下补液，3 d后半流质饮食，逐步过渡到正常饮食。

1.3血糖及胰岛素检测手术组于术后1、4、8周(模型组、空白组于同一时间)在大鼠尾端静脉取血，用血糖仪测定大鼠空腹血糖。眼内眦采集静脉血1 mL，室温静置于离心管30 min自凝，5 000r/min离心10 min后取上清，采用ELISA法检测血清胰岛素。

1.4回肠组织中GLUT-1检测术后8周，将各组大鼠颈椎脱臼处死，取末端回肠3~4 cm，置于4%多聚甲醛固定15 min，冰冻切片，血清封闭，37 ℃恒温孵育2 h，Antihu(鼠抗人，1∶150)+0.03% TritonX-100，4 ℃过夜，PBS漂洗，加入荧光二抗Cy3(驴抗鼠，1∶800)、GLUT-1R(兔抗鼠，1∶100)、二抗FITC(山羊抗兔，1∶150)，甘油封片，荧光显微镜下观察。随机选取10个高倍视野(200×)，记录每个视野阳性细胞数目，取均值。冰块上切取回肠组织5~8 cm，迅速液氮冻存；抽提蛋白质，Western blotting法检测GLUT-1，用ZEISS全自动图像分析仪及VIDAS数据分析仪，测定目的条带的灰度值，以此作为蛋白相对表达量。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1三组空腹血糖、空腹胰岛素水平比较手术组术后1、4、8周后空腹血糖、空腹胰岛素水平与术前相比，P均<0.01；手术组、空白组术后1、4、8周空腹血糖及空腹胰岛素水平与模型组相比，P均<0.01。见表1。

表1　 三组大鼠手术前后空腹血糖、空腹胰岛素

水平比较( ± s)

表1　 三组大鼠手术前后空腹血糖、空腹胰岛素

组别空腹血糖(mmol/L)空腹胰岛素(mIU/L)手术组 术前19.56±2.178.93±0.75 术后1周5.28±2.21*#4.98±0.84*# 术后4周5.52±2.24*#4.13±0.72*# 术后8周5.57±2.15*#4.25±0.85*#模型组 术前19.34±2.348.89±1.41 术后1周19.56±2.788.76±1.73 术后4周20.61±2.439.01±2.46 术后8周18.98±2.268.86±1.86空白组 术前5.62±0.65#3.88±0.68# 术后1周5.35±0.71#4.02±0.54# 术后4周5.49±0.46#3.95±0.76# 术后8周5.61±0.57#4.11±0.77#

注：与同组术前相比，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.01。

2.2三组回肠组织中GLUT-1表达比较手术组、模型组、空白组GLUT-1阳性细胞数分别为(226±7)、(78±5)、(46±4)个，三组两两相比，P均<0.01。手术组、模型组、空白组回肠组织中GLUT-1相对表达量分别为1.642 1±0.213 4、0.723 2±0.126 2、0.315 4±0.075 1，三组两两相比，P均<0.01。见图1。

注：1为空白组；2为模型组；3为手术组。

图1各组大鼠回肠组织中GLUT-1表达比较

3讨论

糖尿病是危害人类健康的常见病、多发病。针对T2DM因胰岛素抵抗或(和)胰岛素分泌缺陷引起的高血糖及并发症，传统治疗手段以控制饮食、服用降糖药物、注射胰岛素为主，但很难达到治愈的效果。目前，关于减重手术治疗糖尿病的研究逐渐增多。治疗糖尿病的手术有多种类型，主要包括吸收不良型手术、限制性手术和两者结合的术式[8]。DJB手术在传统减重手术治疗机制的基础上，保留胃容积、将近端十二指肠旷置，用以治疗非肥胖型T2DM。在本研究中，手术组术后8周大鼠空腹血糖值由(19.56±2.17)mmol/L下降到(5.57±2.15)mmol/L，降糖作用明显。

DJB手术治疗T2DM的机制一直未明，主要有以下几种假说[9~12]：①肠-胰岛轴假说；②脂肪-胰岛轴假说；③胰岛素样生长因子假说；④肠道菌群改变假说。葡萄糖调节是一个全身性、复杂、有序、精密调控的过程，多种激素和生长因子相互协调。作为葡萄糖进出细胞的载体，GLUTs起重要作用。其中，GLUT-1在人体内分布最为广泛，同时也是对体内微环境变化反应最为灵敏的GLUTs之一[13]。细胞糖代谢的第一个限速步骤是葡萄糖摄入，GLUT-1在此过程的调节中发挥重要作用[14]。体外细胞实验发现GLUT-1的调控与细胞对葡萄糖的需求相一致[15]，GLUT-1的调控包括急性调控及慢性调控两个方面。急性调控主要是调控GLUT-1从细胞内的贮存囊泡向细胞膜的转位和GLUT-1内在活性方面，并不涉及GLUT-1 mRNA和蛋白质的合成调节。细胞膜上的GLUT-1在应激情况下会发生转位进而使葡萄糖分子进入细胞的数量大幅度增加，同时GLUT-1的亚细胞分布也受细胞生长状态的影响。

本研究结果显示，手术组GLUT-1表达高于模型组及空白组，提示DJB手术能上调T2DM大鼠回肠组织中GLUT-1的表达水平，进而降低血糖水平。我们还发现，模型组与手术组大鼠术前伴有高胰岛素血症，存在严重的胰岛素抵抗，而手术组术后胰岛素水平降低，低于模型组，推测DJB手术可能还有纠正胰岛素抵抗的作用，与调节GLUT-1表达共同达到降低血糖的效果。

总之，DJB手术可降低T2DM大鼠血糖水平，上调回肠组织中GLUT-1表达，其降糖作用可能与调节GLUT-1表达有关。

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