周络通对糖尿病大鼠周围神经形态学改变及神经生长因子含量的影响

周络通对糖尿病大鼠周围神经形态学改变及神经生长因子含量的影响

姚鸿萍，封卫毅*，魏友霞

(西安交通大学医学部第一附属医院药学部，西安710061)

摘要：目的观察周络通对糖尿病大鼠周围神经形态学改变及神经生长因子(NGF)含量的影响。方法采用链脲佐菌素糖尿病大鼠(STZ-D)模型，灌胃给药8周，锇酸染色观察坐骨神经形态变化，用ELISA法测定糖尿病大鼠血清中的NGF含量，用免疫组化法测定神经组织中NGF含量。结果周络通对糖尿病大鼠坐骨神经形态学改变有明显保护作用；对血清NGF含量减少有明显提高作用；对坐骨神经组织中NGF的含量虽无明显影响，但对坐骨神经轴突内NGF的减少有明显的提高作用。结论周络通对糖尿病大鼠周围神经病变具有保护作用，对血清和坐骨神经轴突内NGF的减少具有明显的提高作用。

关键词：周络通；糖尿病周围神经病变；神经生长因子

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.017

中图分类号：R965文献标志码：A

作者简介：姚鸿萍，女，硕士研究生，副主任药师

收稿日期：(2015-03-22)

Effect of Zhouluotong on sciatic nerve morphology and nerve growth factor contents in streptozotocin-induced diabetic rats

YAO Hongping，FENG Weiyi*，WEI Youxia (Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital， Health Science Center，

Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061， China )

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Zhouluotong on sciatic nerve morphology and nerve growth factor contents in streptozotocin-induced diabetic (STZ-D) rats with diabetic peripheral neuropathy (DPN). MethodsDrugs were administrated orally for 8 weeks continuingly after the streptozotocin treatment. Morphological changs in sciatic nerve were observed with histological staining. Nerve growth factor(NGF) contents in plasma and sciatic nerve tissues were determined with ELISA kit and immunohistochemical staining. ResultsMorphological degeneration in sciatic nerve， decrease of nerve growth factor concertration in rat plasma， as well as in nerve axis cylinder were ameliorated by oral administration of Zhouluotong to diabetic rats.Conclusion These observations suggested that Zhouluotong demonstrated curative effect on DPN in STZ-D rats.

Key words: Zhouluotong；diabetic peripheral neuropathy；nerve growth factor

*通信作者:封卫毅，男，博士研究生，主任药师

糖尿病神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病三大并发症之一，其发病率和死亡率较高[1]，目前尚没有特效的治疗药物。DPN的发生与体内多种神经体液代谢紊乱有关，其中神经生长因子(nerve growth factor， NGF)含量异常是引起DPN的重要原因之一[2-4]。在周络通临床应用中发现，该药对糖尿病患者的某些外周神经并发症，如:麻木、肢体感觉异常、疼痛等具有明显的改善作用。而我们前期的研究发现[5]，周络通对神经组织多元醇代谢通路的增强具有明显的抑制作用，并可降低神经组织中损伤性多元醇物质的生成。因此，本文以链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠为模型，对周络通防治DPN进行进一步的研究。

1仪器与材料

1.1仪器MK3酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司)；H8-202AN显微镜(美国Nikon公司)；Polaroid数字显微照相机(Polaroid DMC公司)。

1.2试药周络通(河北以岭医药研究院)；链脲佐菌素(Sigma公司)；甲钴胺片(日本卫材株式会社)；兔抗鼠神经生长因子抗体(Santa Cruz公司)；二抗及SABC试剂盒(武汉博士德生物技术公司)；大鼠神经生长因子酶联免疫试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)。

1.3动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体质量150～280 g，中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号：医京动字第3008号。

2方法

2.1动物模型制备、分组和给药将链脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液(pH 4.5)配成10 g·L-1的溶液，备用。取Wistar大鼠，分为空白对照组和造模组，造模组腹腔注射40 mmol·L-1的链脲佐菌素70～75 mg·kg-1，空白对照组注射相同剂量的柠檬酸缓冲液。给药后72 h，从造模组大鼠的眼眶取血，测定血糖值，选择血糖水平在16 mmol·L-1以上的动物为模型成功动物。将模型成功动物随机分为5组：模型组、甲钴胺对照组(175 μg·kg-1)、周络通6.0，3.0 和1.5 g·kg-1组。药物溶解于5 g·L-1CMC-Na溶液中，大鼠每天灌胃给药，给药剂量0.01 mL·g-1，连续给药8周。空白对照组和模型组每天灌胃给予相同剂量的CMC-Na溶液。

2.2坐骨神经病理变化的定性及定量观察

2.2.1锇酸染色及HE染色大鼠连续给药8周后，取左侧坐骨结节以下约3 cm的坐骨神经，其中的1.5 cm放入40 mmol·L-1锇酸溶液中染色12 h，用石蜡包埋并切片，以观察坐骨神经髓鞘的变化情况。另外的1.5 cm以1.33 mol·L-1甲醛溶液固定后，苏木素-伊红进行染色(HE染色)，石蜡包埋并切片，以观察坐骨神经形态的变化。

2.2.2坐骨神经形态的半定量观察观察锇酸染色的坐骨神经纵切面上25～30根有髓神经纤维，统计发生神经病变(结间隙增多、磷脂过度褶皱、节段性脱髓鞘、结周脱髓鞘、髓鞘发生溃变)的纤维数量，计算其占总纤维数的百分率[1]。在HE或锇酸染色的坐骨神经横切面上，随机取2～3个视野，统计神经纤维最密集区0.025 mm×0.025 mm范围内的神经纤维数。每一视野在不同方向上重复测3次，计算平均数[6]。

2.3大鼠血清中NGF的含量测定大鼠麻醉后，颈总动脉取血并分离血清。依照NGF酶联免疫检测试剂盒说明书上的操作方法进行NGF含量测定。

2.4坐骨神经组织中NGF的含量测定

2.4.1免疫组织化学染色(漂染ABC法)以1.33 mol·L-1甲醛固定的大鼠坐骨神经石蜡切片，常规脱蜡，经0.88 mol·L-1H2O2灭活、复合消化液酶修复、山羊血清封闭、一抗、二抗孵育后，加SABC试剂显色，后漂洗、脱水，透明后封片。

2.4.2坐骨神经组织中NGF的含量测定依据文献中的方法[7]进行：按照2.4.1中的方法进行染色后，在横向切片上，显微镜随机选2个视野，数字显微照相机采集图像，对坐骨神经着色分别进行光密度分析，对比各组之间平均光密度值。另外，在每一坐骨神经横向切片上随机选2个视野，每一视野观察50根神经纤维，根据髓鞘内神经轴突NGF染色由深、较深、浅到无染色的不同进行计数，分别按3，2，1和0进行评分，统计各标本的分值，并进行组间比较。

3实验结果

3.1周络通对糖尿病大鼠坐骨神经形态学变化影响的定性观察在锇酸染色的坐骨神经组织切片上，与空白对照组相比，模型组神经纤维某些部位有神经纤维发生溃变或断裂现象；朗飞氏结的结间隙变宽；部分神经纤维髓鞘局部发生肿胀；神经髓鞘内出现许多小块状类脂变性的凝集小块，髓鞘在多数染色较淡，显示存在一定的损伤反应。周络通6.0,3.0和1.5 g·kg-1组和甲钴胺组均仍可见到有神经纤维髓鞘变性发生，但较模型组有不同程度地减轻。结果见图1。

图1周络通对糖尿病大鼠坐骨神经形态学的影响(×40)

A.空白对照组；B.模型组；C.周络通6.0 g·kg-1组； D.周络通5.0 g·kg-1组；E.周络通1.5 g·kg-1组

Fig.1 Effects of Zhouluotong on morphology of sciatic nerve in STZ-D rats(×40)

A.control group； B.model group； C.Zhouluotong group(6.0 g·kg-1)；D.Zhouluotong group(3.0 g·kg-1)； E.Zhouluotong group(1.5 g·kg-1)

3.2周络通对STZ-D大鼠坐骨神经形态学变化影响的半定量观察糖尿病大鼠模型组坐骨神经纤维发生溃变等病变的比例明显高于空白对照组(P<0.01)。而周络通各给药组和甲钴胺组与模型组比较，均具有显著性差异(P<0.01)。结果见表1。

表1周络通对糖尿病大鼠坐骨神经纤维变性发生率的影响

Tab.1 Effect of Zhouluotong on degeneration incidence in sciatic nerve of STZ-D rats

± s)

注：与模型组比较**P<0.01。

神经纤维计数结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠坐骨神经横切面上单位面积中的坐骨神经纤维数明显增多，神经纤维直径显著缩小，表明糖尿病大鼠神经纤维存在萎缩现象(P<0.01)。各给药组大鼠的坐骨神经纤维数少于模型组(P<0.05或P<0.01)，表明周络通对糖尿病大鼠神经纤维的萎缩具有一定的保护作用。结果见表2。

3.3周络通对STZ-D大鼠血清中NGF含量的影响酶联免疫方法测定结果表明，模型组糖尿病大鼠血清NGF含量为21.3±2.4 pg·mL-1，较正常组30.6±9.4 pg·mL-1有明显减少(P<0.01)。与模型组比较，周络通6.0和3.0 g·kg-1组和甲钴胺组血清NGF含量有明显升高(P<0.05)。结果见表3。

表2周络通对糖尿病大鼠坐骨神经纤维计数的影响

Tab.2 Effect of Zhouluotong on the count of sciatic nerve fiber in STZ-D rats

± s)

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表3周络通对糖尿病大鼠血清中NGF含量的影响

Tab.3 Effects of Zhouluotong on the contents of NGF in serum of STZ-D rats

± s, n=11)

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

3.4周络通对STZ-D大鼠坐骨神经组织NGF含量的影响

3.4.1免疫组织化学染色正常组大鼠坐骨神经束髓鞘和髓鞘内神经轴突均被明显深染，显示神经束髓鞘和髓鞘内NGF含量较高。在神经束之间可见到染色很深的Schwann细胞，表明Schwann细胞内富含NGF。模型组大鼠的坐骨神经横切片上，被深染的Schwann细胞较少，神经束髓鞘虽被染色，但髓鞘内神经轴突部位染色很浅甚至未染色，并出现许多空腔样结构。各给药组大鼠坐骨神经横切面上虽然被深染的Schwann细胞较少，但神经束髓鞘明显被染色；髓鞘内神经轴突染色虽然较浅，但颜色要深于模型组，空腔样的纤维束数量较模型组明显要少。表明周络通对糖尿病大鼠坐骨神经轴突内NGF的减少有一定的抑制作用。结果见图2。

图2周络通对糖尿病大鼠坐骨神经中NGF质量浓度的影响(×40)

A.空白对照组；B.模型组；C.周络通6.0 g·kg-1组；D.周络通3.0 g·kg-1组；E.周络通1.5 g·kg-1组

Fig.2 Effects of Zhouluotong on the contents of NGF in sciatic nerve of STZ-D rats(×40)

A.control group； B.model group； C.Zhouluotong group(6.0 g·kg-1)； D.Zhouluotong group(3.0 g·kg-1)； E.Zhouluotong group(1.5 g·kg-1)

3.4.2坐骨神经组织中NGF的含量测定对坐骨神经横断面NGF免疫组织化学染色平均光密度测定结果显示，模型组平均光密度值明显小于正常组(P<0.01)。与模型组相比，各给药组坐骨神经NGF染色的平均光密度值无明显变化(P>0.01)；坐骨神经轴突内NGF含量评分结果表明，模型组大鼠NGF含量评分明显低于正常组(P<0.01)，与模型组比较，各给药组NGF含量评分值明显增加(P<0.05或P<0.01)，显示周络通对神经束轴突内的NGF含量有明显升高作用。结果见表4。

表4周络通对糖尿病大鼠坐骨神经中NGF含量和NGF含量评分的影响

Tab.4 Effects of Zhouluotong on the contents and scores of NGF in sciatic nerve of STZ-D rats

组别 剂量n平均光密度神经轴突内NGF评分空白对照组-8 0.196±0.019**128.1±10.7**模型组 -80.091±0.01381.0±16.8甲钴胺 175μg·kg-180.092±0.019104.1±14.1**周络通 6.0g·kg-190.089±0.018100.6±19.9*周络通 3.0g·kg-180.088±0.01596.0±10.2*周络通 1.5.g·kg-190.092±0.010100.9±11.5*

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

4讨论

NGF是胚胎感觉、交感神经生长发育必不可少的物质，对成年神经组织有营养作用。有人认为NGF是经神经末梢逆转运至核周质，通过调节神经细丝蛋白 mRNA的合成、维持轴索直径而发挥作用[8]。此外，NGF对神经髓鞘的Schwann细胞也有调节作用[9]，可维持神经结构和神经功能的完整性，并能促进神经损伤后的再生。研究发现，糖尿病神经病变患者和动物的血液、组织中的NGF水平均明显降低[10-11]，NGF在感觉和交感神经轴索中的逆转运也降低[12]，这种NGF合成和转运的缺陷在糖尿病时除可造成神经的营养障碍外，还可能使神经组织对其他的损伤因素更为敏感。此外，应用外源性NGF和内源性NGF刺激物可预防糖尿病神经功能的改变。因此，NGF缺乏与DPN的发生密切相关。血清中的NGF含量反映了机体的NGF水平，神经组织轴突内NGF的含量反映神经组织靶器官的NGF合成和输送能力。我们前期实验结果表明，造模8周后，糖尿病大鼠的外周神经传导速度明显减慢，并出现糖尿病外周神经病变的一系列症状[5]。而该实验结果显示，造模后8周，糖尿病大鼠血清中的NGF明显下降，与模型组比较，周络通6.0和3.0 g·kg-1组和甲钴胺组可明显增加血清NGF含量，显示对DPN具有一定的防治效果。

与功能变化和生化指标异常改变相比，链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠的组织形态学改变程度稍轻一些，很难看到明显的神经纤维丢失或神经纤维变性，但依然可见纤维变小、萎缩等现象。在病程较长时可观察到部分神经纤维发生肿胀和脱髓鞘，在超微结构检查中甚至可发现结周轴-神经胶质脱失的现象[13-14]。本次实验结果发现，与正常组比较，链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠神经纤维髓鞘损伤发生率明显增加，部分神经纤维髓鞘甚至发生变性。周络通虽不能完全逆转神经病变的发生，但可明显降低神经纤维变性损伤的发生率，对坐骨神经纤维的萎缩、变小均表现出明显抑制作用，显示药物对外周神经组织的形态学改变也具有明显保护作用。

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