原儿茶酸对大鼠心肌缺血／再灌注损伤的保护作用

原儿茶酸对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

覃华1，张琰1，杜小燕1，崔颖2，王茹1*

(1.第四军医大学唐都医院药剂科，西安 710038； 2.第四军医大学唐都医院输血科，西安 710038)

摘要：目的研究原儿茶酸对大鼠心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤的保护作用。方法采用结扎SD大鼠冠状动脉建立MI/R (30 min/3 h)损伤模型，将动物随机分为假手术组、模型组、原儿茶酸组(低、中、高剂量)、丹参多酚酸盐6组。除模型组于再灌注时给予生理盐水外，原儿茶酸低、中、高剂量组及丹参多酚酸盐组于再灌注即刻给予原儿茶酸(5，10和20 mg·kg-1)及丹参多酚酸盐(20 mg·kg-1)。实验过程中监测心功能，实验末测定心肌梗死面积，并检测血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTnI)水平。结果与模型组相比，原儿茶酸中、高剂量组大鼠心功能得以改善(P<0.05)，心肌梗死面积显著减少(P<0.05)，血清中心肌损伤酶CK-MB、cTnI的水平显著下降(P<0.05)。结论原儿茶酸对大鼠MI/R损伤具有一定的保护作用。

关键词：原儿茶酸；心肌缺血/再灌注；心功能；心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.016

中图分类号：R965文献标志码：A

基金项目：国家自然科学基金青年科学

作者简介：覃华，女，主管药师

收稿日期：(2015-03-02)

Protective effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats

QIN Hua1，ZHANG Yan1，DU Xiaoyan1，CUI Ying2，WANG Ru1*(1.Department of Pharmacy，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710038，China；2.Department of Blood Transfusion, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protection effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury in rats. Methods The rats were subjected to MI/R (30 min/3 h) by occluding the left anterior descending artery. The rats randomly received one of the following treatments intravenously and were randomly divided into six groups: sham group，model group，protocatechuic acid group (low，middle and high doses) and salvianolate group. Sham-operated control rats (sham) underwent the same surgical procedures with the exception of left anterior descending coronary artery occlusion. Protocatechuic acid and salvianolate groups were treated with the dose of 5，10 and 20 mg·kg-1 of protocatechuic acid and 20 mg·kg-1 of salvianolate， respectively. The change of cardiac function was monitored by multi-channel physiology recorder. The area of myocardial infarction and the levels of CK-MB，cTnI in serum were determined to evaluate the protection effect of protocatechuic acid. Results Compared with the model group，the cardiac function of MI/R rats was improved(P<0.05)，the infarct area and the levels of creatine kinase-MB (CK-MB) and cardiac troponin (cTnI) in the middle and high dose of protocatechuic acid groups were significantly decreased (P<0.05).ConclusionProtocatechuic acid has excellent cardioprotective effects against MI/R injury in rats.

Key words: protocatechuic acid；myocardial ischemia/reperfusion；cardiac function； myocardial infarction

*通信作者：王茹，女，副主任药师

冠状动脉性心脏病(coronary artery heart disease，CAHD，简称冠心病)对生命和健康的威胁很大，是当今造成人类死亡的头号杀手。临床上冠脉支架、溶栓及搭桥血管重建术等已成为传统的治疗方法，但在心脏血运重建过程中反而出现比心肌缺血更明显、更严重的损伤和功能障碍，称为再灌注损伤。目前，关于心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤领域的研究已经受到医药学家的高度关注，探讨如何减轻MI/R损伤是研究的热点[1-2]。中药治疗MI/R损伤疗效确切、前景良好[3]，其中丹参(Salviamiltiorrhizae)心肌保护作用的研究最为引人关注。丹参早已被广泛应用于治疗冠心病、脑卒中、动脉粥样硬化等[4-6]。早在90年代，W. Zhou等的研究表明：丹参水溶性成分在大鼠离体心脏上具有防治MI/R损伤的保护作用[7]。同时，游勇基等通过高效液相色谱法，测定丹参中4种主要的水溶性成分：丹酚酸B(salvianolic acid B)、丹参素(danshensu)、原儿茶醛(protocatechuic aldehyde)、原儿茶酸(protocatechuic acid)[8]，但迄今为止原儿茶酸防治MI/R损伤的研究却鲜有报道。本实验拟通过结扎大鼠冠状动脉模拟MI/R损伤模型，探究原儿茶酸是否具有抗MI/R损伤的作用。

1仪器与试药

1.1仪器RM-4200多道生理记录和分析处理系统,由成都仪器厂提供。

1.2试剂原儿茶酸(protocatechuic acid)由南京替斯艾么中药研究所提供；注射用丹参多酚酸盐(Salvia miltiorrhiza polyphenols acid salt，SMPAS)由上海绿谷制药有限公司提供；肌酸激酶同工酶(CK-MB)，肌钙蛋白(cTnI)由上海西唐生物科技有限公司提供；2，3，5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)染色剂由中国医药集团上海化学试剂公司提供；伊文思蓝(EB)由美国Sigma-Aldrich公司提供。

1.3动物SD雄性大鼠48只，清洁级，鼠龄3个月，质量250～300 g，由第四军医大学实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK-(军)2007-007。

2方法

2.1MI/R模型使用30 g·L-1的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉SD大鼠后，接RM-4200多道生理记录监测心电变化。气管插管之后，接小动物呼吸机。分离气管后经右颈总动脉插管至左心室，记录左室压及其微分。于左侧第3～4肋骨间打开胸腔，暴漏心脏后，在左冠状动脉前降支起始2 mm处进针，待呼吸、血压平稳后用5～0号无损伤缝合线穿过心肌层结扎，结扎线远端心肌颜色发绀。缺血60 min后解除结扎再灌注3 h。以心电图ST段抬高为结扎成功[9]。

2.2实验分组随机将实验SD大鼠分为6组，分别是假手术组、模型组和原儿茶酸组及阳性对照丹参多酚酸盐组。在原儿茶酸组中分为3个剂量组，分别是5，10和20 mg·kg-1，假手术组只进行穿线不结扎；模型组于颈静脉给予生理盐水；原儿茶酸组及丹参多酚酸盐组于颈静脉给予原儿茶酸和丹参多酚酸盐。给药时间均为再灌注之前给药。

2.3测定指标

2.3.1心脏功能监测通过多导生理记录仪(RM-4200)持续监测大鼠左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、收缩压最大上升速率(+dp/dtmax)、舒张压最大下降速率(-dp/dtmax)、心率(HR)等心功能指标。

2.3.2心肌梗死面积测定实验结束后颈静脉注射伊文思蓝EB(5 mg·kg-1)2 mL，30 min后打开胸腔，取出心脏，生理盐水充分洗净残血，滤纸吸干，剪去血管、结缔组织、心房和右心室，留下左心室。将左心室置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min，平行房室沟将其切成5～8 片，每片厚1～2 mm。切片置于10 g·L-12，3，5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)中,37 ℃孵育15 min，随后用多聚甲醛固定，正常心肌组织染成蓝色，缺血心肌组织染成红色，梗死心肌组织为白色。将切片展开平铺于载玻片上，采用数码相机拍摄，导出的照片利用图像分析软件Image ProPlus计算梗死面积[10]。

2.3.3血清生化指标测定实验结束后，从SD大鼠颈动脉取血，室温静置20 min，3 500 r·min-1离心12 min,取血清，按照试剂盒说明书严格操作检测CK-MB和cTnI水平。

3结果

3.1大鼠心功能的变化再灌注60和120 min大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR的变化如表1所示。研究发现在灌注时不同时间点的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR均降低(P<0.05)。原儿茶酸组20 mg·kg-1及丹参多酚酸盐组，以上参数较模型组均升高(P<0.05)。详细结果见表1。

表1原儿茶酸对MI/R损伤大鼠心功能的影响

Tab.1Effect of protocatechuic acid on cardiac function against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：与假手术组比较#P< 0.05；与模型组比较*P< 0.05。

3.2大鼠心肌梗死面积的变化伊文思蓝及TTC染色的心脏切片见图1。与模型组比较，原儿茶酸组的大鼠心肌梗死面积减少(P<0.05)。尤其是20 mg·kg-1组，梗死面积显著下降，但与丹参多酚酸盐组之间无显著性差异(P>0.05)，详细结果见表2。

图1TTC染色后心肌组织的典型图片

A.假手术组；B.模型组；C.原儿茶酸 (5 mg·kg-1)组；D.原儿茶酸(10 mg·kg-1)组；E.原儿茶酸(20 mg·kg-1)组；F.丹参多酚酸盐组

Fig.1 Representative photographs of heart tissues taken from rats after TTC staining

A.sham operation group；B.model group;C.the model group of protocatechuic acid group(5 mg·kg-1);D.the model group of protocatechuic acid group(10 mg·kg-1);E.the model group of protocatechuic acid group(20 mg·kg-1);F.Salviamiltiorrhizagroup

表2原儿茶酸对MI/R损伤大鼠心肌梗死面积的影响

Tab.2Effect of protocatechuic acid on myocardial infarct area against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：与假手术组比较#P<0.05；与模型组比较*P< 0.05。

3.3大鼠血清中CK-MB和cTnI水平的变化血清中心肌酶CK-MB和cTnI的水平见表3。与假手术组相比，模型组血清中CK-MB和cTnI的水平显著升高(P<0.05)，与模型组比较，原儿茶酸组以上心肌酶水平降低。尤其是10和20 mg·kg-1剂量组，CK-MB和cTnI水平下降显著(P<0.05)。

表3原儿茶酸对MI/R损伤大鼠血清中CK-MB，cTnI水平的影响

Tab.3 Effect of protocatechuic acid on the levels of CK-MB，cTnI in serum against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：与假手术组比较#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

4讨论

近年来，中医药对MI/R损伤的治疗作用日趋重视，其中丹参的治疗效果最引人关注[7]。其化学成分主要为水溶性成分和脂溶性成分两部分。众所周知，传统中药在使用时多用其水煎成分，因而近年来关于丹参水溶性成分的研究较多[11]。有报道认为丹参素作为丹参的主要水溶性成分，在SI/R(simulated ischemia/reperfusion)损伤的H9c2心肌细胞上，通过激活PI3K/Akt、ERK1/2信号通路发挥抗心肌细胞凋亡的作用[12]。另一种水溶性成分丹酚酸A被报道在体内外实验中均具有防治MI/R损伤的保护作用[13]。然而，作为丹参中主要的水溶性成分之一的原儿茶酸关于防治MI/R损伤的作用却尚未报道。

现代研究表明，氧化应激、钙超载、白细胞激活以及能量代谢障碍等是引起MI/R损伤的主要因素，其中导致损伤最严重、时程最长的因素为氧化应激[14]。原儿茶酸的相对分子质量仅154 g/mol，为小分子化合物。化学结构中含有一对邻二酚羟基，具有氧自由基清除作用。

本研究通过检测心功能、心肌梗死面积及心肌损伤酶等指标来评价原儿茶酸在大鼠MI/R模型上的治疗作用。现代医学认为，心功能的变化与心肌MI/R损伤的程度密切相关，心脏的工作性能主要取决于心室肌的收缩和舒张性能[15]。本研究结果显示，MI/R后大鼠LVEDP明显升高，LVSP、+dp/dtmax明显降低，即心脏发生静脉张力升高，张力降低，心肌收缩功能下降。结果发现，原儿茶酸可不同程度地改善MI/R损伤引起的心脏舒缩功能障碍。心肌梗死面积与心功能密切相关，在临床上对预后和评价治疗效果都具有重要意义。梗死面积的衡量也被认为是评价MI/R损伤的标准之一[16]。本研究通过TTC染色后测定大鼠心肌梗死面积，发现原儿茶酸可以减少MI/R损伤的心肌梗死面积。同时，在心肌MI/R损伤时能引起受损心肌细胞心肌酶的释放。临床上特异性的心肌酶也被认为是MI/R损伤诊断的重要指标。其中cTnI和CK-MB通常被认为是急性心肌损伤的标志物[17]。通过检测以上心肌酶。我们发现MI/R损伤大鼠血清中的cTnI和CK-MB的水平升高，而原儿茶酸能够降低血清中以上2种心肌酶的水平。

综上所述，本研究发现原儿茶酸能够改善MI/R损伤时的心功能，减小心肌梗死面积，同时降低血清中标志性的心肌酶cTnI和CK-MB的释放，效果不劣于阳性对照药丹参多酚酸盐，证实原儿茶酸具有防治MI/R损伤的作用，但具体的分子机制还有待进一步研究。

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