HPLC法测定药材贯叶金丝桃中金丝桃苷和槲皮素的含量

HPLC法测定药材贯叶金丝桃中金丝桃苷和槲皮素的含量

田红林1，成杰2，轩辕欢1*

(1.新疆医科大学附属中医医院药学部，乌鲁木齐830004；2.武警新疆总队医院药局，乌鲁木齐830091)

摘要：目的建立测定药材贯叶金丝桃中槲皮素和金丝桃苷含量的方法。方法采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱柱：Hypersil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-4 mL·L-1磷酸(30/70)，流速1.0 mL·min-1；检测波长(241，360 nm)；柱温30 ℃；进样量20 μL。结果槲皮素和金丝桃苷浓度分别在0.02～10和0.03～8 μg·mL-1质量范围内与峰面积积分分值呈良好线性关系。加样回收率分别为98.0%和98.1%。结论该方法专属性强，灵敏度高，重复性好，可作为该药材测定槲皮素和金丝桃苷质量控制的方法。

关键词：贯叶金丝桃；槲皮素；金丝桃苷

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.009

中图分类号：R282文献标志码：A

作者简介：田红林，男，副主任中药师

收稿日期：(2015-03-10)

Content determination of hyperoside and quercetin inHypericumperforatumby HPLC

TIAN Honglin1，CHENG Jie2，XUANYUAN Huan1*(1.Department of Pharmacy，the Sixth Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830004，China；2.Armed Police Xinjiang Hospital Pharmacy，Urumqi 830009，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of hyperoside，quercetin in Hypericum perforatum by HPLC. MethodsThe chromatographic conditions were as follows：Hypersil CN (150 mm×4.6 mm，5 μm) column；a mobile phase of methanol -4 mL·L-1 phosphate (30/70)，a flow rate of 1 mL·L-1；the detection wavelength 241，360 nm；the column temperature 30 ℃；the sample size 20 μL. ResultsHyperin and quercetin, with in the concentration of 0.02-10 and 0.03-8 μg·mL-1respectively showed a good linear relationship. Recoveries were 98.0% and 98.1% respectively. ConclusionThe method has high specificity，sensitivity，and good reproducibility，and can be used as a method for quercetin and hyperoside determination.

Key words:Hypericumperforatum；quercetin；hyperin

*通信作者：轩辕欢,男,助理中药师

贯叶金丝桃HypericumperforatumL.又名贯叶连翘，为藤黄科Guttiferae金丝桃属HypericumLinn多年生草本植物[1]，其味苦、辛、性寒，具有疏肝解郁、清热利湿、消肿通乳之功效[2-4]，主治湿寒性或黏液质性关节痛及湿寒创伤久而不愈等[5-6]。现代研究表明，其主要成分有黄酮类、酚类、挥发油等，贯叶金丝桃中的金丝桃素在体内具有抗抑郁、抗病毒、治疗创伤等多种作用[7]。本研究针对贯叶金丝桃采用高效液相色谱法(HPLC)测定金丝桃苷、槲皮素的含量，为贯叶金丝桃药材的质量控制和安全有效提供理论依据。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(包括LC-15C泵，SPD-10A检测器)(Shimadzu，日本)；岛津高效液相色谱LC工作站；色谱柱：Hypersil CN(50 mm×4.6 mm，5 μm)(大连依利特分析仪器有限公司)；XW-80A型漩涡混合器；DSHZ-300型恒温水浴振荡器(江苏实验设备厂)。

1.2试药贯叶金丝桃(购自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐维吾尔药市场)，经新疆医科大学第六附属医院魏敏助理研究员鉴定为贯叶金丝桃HypericumperforatumL.的干燥地上部分；槲皮素对照品(质量分数>98%，中国食品药品检验所提供，批号20091020)；金丝桃苷对照品(质量分数>98%)；甲醇(色谱纯)；正辛醇、磷酸、二甲亚砜(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Hypersil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-4 mL·L-1磷酸(30/70)；流速1.0 mL·min-1；检测波长：241 和360 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。见图1。

图1HPLC图

A.空白甲醇；B.槲皮素和金丝桃苷混合标准溶液；C.供试品溶液；1.槲皮素；2.金丝桃苷

Fig.1HPLC chromatograms

A.methanol；B.quercetin，hyperin mixed standard solution；C.test sample；1.quercetin；2.hyperin

2.2对照品溶液的制备精密称取金丝桃苷、槲皮素对照品适量，分别加甲醇制成 40.1和44.8 mg·L-1的溶液，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备取贯叶金丝桃药材适量粉碎，过三号筛，粉末精密称定0.40 g，置于50 mL量瓶中,加甲醇适量，超声处理(功率500 W，频率400 kHz)30 min，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤液经0.45 mm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4阴性液制备及干扰实验按处方制备不含贯叶金丝桃的阴性样品，按2.3项下方法制备贯叶金丝桃空白溶液，依法测定，结果无干扰。

2.5系统适用性实验精密称取槲皮素和金丝桃苷对照品1 mg，用DMSO配制成质量浓度为1 mg·L-1的标准储备液。标准储备液用甲醇配制成质量浓度为0.02，0.10，0.20，1.00，5.00，20.00和50.00 μg·L-1的标准稀释液，置于4 ℃下保存，于上述色谱条件下测定，重复3次。色谱峰面积(Y)与质量浓度(X)呈良好的线性关系，所得线性方程即为标准方程。槲皮素线性方程为：Y=55.078X+2 726.9，r=0.999 9；金丝桃苷线性方程为：Y=39.077X+2 335.5，r=0.999 9。结果表明：槲皮素和金丝桃苷在0.02～10.0和0.03～8.00 μg·mL-1质量浓度范围内，与峰面积积分分值呈良好线性关系。

2.6精密度实验精密吸取供试品溶液连续进样5次，进样体积20 μL，在上述色谱条件下，测定色谱峰面积，实验结果表明，日内及日间精密度均小于2%，精密度较好。

2.7稳定性实验精密吸取同一供试品溶液20 μL，每隔2 h进样1次(4次)，在上述色谱条件下，测定槲皮素和金丝桃苷的峰面积，结果供试品在8 h内的RSD分别为1.42%和1.37%，结果稳定。

2.8重复性实验按2.3项下方法制备同一批供试品6份溶液，按上述色谱条件测定槲皮素和金丝桃苷含量，RSD分别为0.32%和0.27%，结果表明重复性良好。

2.9回收率实验按2.3项下方法制备本品，取0.2 g，精密称定6份，置于50 mL量瓶中，第1份作为空白，其余6份精密加入槲皮素和金丝桃苷对照品，在2.1项色谱条件下，进行含量测定，计算回收率，结果见表1。

表1槲皮素和金丝桃苷加样回收率测定

Tab.1 Recovery of quercetin，hyperin

试药称样量/g样品含量/mg测定含量/mg回收量/mg回收率/%加样回收率/%RSD/%槲皮素0.20020.43281.23090.451997.0598.041.420.20050.41031.13020.441498.890.20010.43371.20090.432098.18金丝桃苷0.20150.41281.21320.450897.1798.101.370.20190.43091.13890.431799.440.20080.41921.23410.429897.48

2.10 样品测定取3批样品，按2.3项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液20 μL，在2.1项色谱条件下进行测定，记录峰面积，计算样品中槲皮素和金丝桃苷的含量，结果3批贯叶金丝桃中槲皮素含量为7.15，6.79和7.55 mg·g-1，金丝桃苷含量为5.14，5.48和5.01 mg·g-1。

3讨论

本研究中考察了甲醇、无水乙醇超声法提取供试品[8-9]，结果发现,无水乙醇提取的供试品分离色谱峰较少，其中只含有槲皮素成分，且杂质峰较多，难以达到实验一测评价2种成分含量的效果。甲醇提取色谱峰分离得较好、提取效率较高。故选用甲醇为溶剂，超声提取法提取。

HPLC测定金丝桃苷测定方法多采用《中国药典》2010年版一部贯叶金丝桃药材项下含量测定方法[2]，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相(乙腈-1 mL·L-1磷酸(16∶84))，本研究经过多次实验、重复比较，结果发现，同时测定槲皮素和金丝桃苷的分离效果较差，因此本实验采用甲醇-4 mL·L-1磷酸[8]，槲皮素和金丝桃苷色谱峰分离度良好，基线平稳。该方法测定贯叶金丝桃药材中槲皮素和金丝桃苷含量，具有专属性强、灵敏度高、重复性好等优点。本研究组针对贯叶金丝桃专属性成分进一步研究，将提供详实的实验数据和理论依据。

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