壳寡糖对仔猪两种免疫器官酶活力的影响

■刘美思 王秀武 许青松 程立坤 尹 恒

(1.中国科学院大连化学物理研究所天然产物及糖工程试验室，辽宁大连 116011；2.辽宁师范大学，辽宁大连 116021；3.大连海洋大学，辽宁大连 116023)

仔猪的免疫能力是养殖者十分关注的问题。学者们通常对仔猪免疫器官[1]、血清[2]或肠道免疫系统[3-4]进行考察，评价其免疫作用。许多仔猪会因免疫力低下而早夭，对饲养者的经济等造成巨大损失。因此，如何有效且健康地提升仔猪的免疫能力，成为畜牧业关注的热点之一。功能性寡糖作为天然、健康的饲料添加剂在养殖产业的使用日趋广泛。有研究指出，饲料中添加4%的果寡糖可以用于提升断奶仔猪的增重，改善肠道功能[5]。也有研究指出，饲料中添加寡糖，对断奶仔猪的生长性能[6]、免疫能力[7]、肠道菌群及消化[8-9]等均有良好的调节作用。Che等(2012)[10]通过猪的体内和体外试验研究发现，甘露寡糖可以作为免疫调节剂直接激活巨噬细胞分泌细胞因子，也可以降低内毒素诱导的细胞因子的过度表达，对宿主的防御和避免有害的过度刺激具有重要作用。

胸腺和脾脏是重要的免疫器官。脾脏中包含着众多免疫细胞，而T细胞在胸腺中成熟。在考察动物免疫力的高低时，胸腺、脾脏的质量及指数经常作为重要的参考指标，然而对两种免疫器官的酶活力的检测却并不常见。本文通过考察饲料中添加COS对仔猪胸腺、脾脏的相关免疫酶活力的影响，探究饲料中添加COS对仔猪免疫的影响，为COS作为饲料中添加的免疫增强剂的研究提供数据积累。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用COS系本试验室自行制备（聚合度在2～8，脱乙酰度＞95%，平均分子量＜1 kDa）。免疫酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。RIPA蛋白裂解液购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 组织样品的采集

本试验在四川省遂宁市高金生态牧业猪场进行。饲养试验共计28 d。试验分为两组，每组10头仔猪，其中一组为对照组，一组为试验组（COS组）。仔猪断奶后，对照组仔猪饲喂基础仔猪日粮，试验组仔猪饲喂含COS（50 g/t）的试验日粮。仔猪饲喂28 d后，屠宰仔猪，取仔猪胸腺、脾脏的样本，生理盐水冲洗后置于灭菌的离心管中，快速存于液氮中。

1.2.2 免疫酶检测

在空白对照组和COS组分别随机抽取5个样本，利用匀浆器和蛋白裂解液将其研磨成浆，低温静置30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清待用。

一氧化氮合酶（NOS）总活力、NOS分型活力及过氧化氢酶（CAT）活力测定根据南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行检测。

1.2.3 统计学分析数据

统计学处理应用SPSS 22.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行方差分析，所有试验数据均以“平均数±标准差”表示，差异显著时对平均值进行Duncan's法多重比较。“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01。

2 试验结果

2.1 COS对仔猪胸腺、脾脏NOS活力的影响

饲料中添加COS对仔猪胸腺、脾脏相关氧化酶活力的影响均通过对组织裂解液的检测来评估。试验结果如图1，COS组的仔猪胸腺、脾脏的NOS活力较空白对照组分别提升了43.5%（P＜0.01）和5.3%。NOS可分为结构型一氧化氮合酶（cNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）两种。NOS分型检测结果如图2、图3、图4，仔猪胸腺cNOS活力显著提升了74.9%（P＜0.01）（见图4），其余样本相关NOS活力变化并不明显。

图1 COS对仔猪胸腺（a）、脾脏（b）NOS活力的影响

图2 COS对仔猪胸腺（a）、脾脏（b）总一氧化氮合酶（TNOS）活力的影响

图3 COS对仔猪胸腺（a）、脾脏（b）iNOS活力的影响

图4 COS对仔猪胸腺（a）、脾脏（b）cNOS活力的影响

2.2 COS对仔猪胸腺、脾脏CAT活力的影响

检测饲料中添加COS对仔猪胸腺、脾脏CAT活力的影响试验结果如图5，COS组的仔猪胸腺的CAT活力较空白对照组提升了45.6%（P＜0.01），脾脏CAT活力比空白对照组提升了49.3%(见图5)。因仔猪样品个体差异较大，所有试验结果方差较大，所以未标记的均没有显著性差异。

3 小结与讨论

图5 COS对仔猪胸腺（a）、脾脏（b）CAT活力的影响

随着对人体健康、环境保护概念的认知程度日益增高，对畜牧业的要求也日渐升高。由于市场需求和经济效益，人们往往通过生长激素、抗生素等促进家禽、家畜的生长和免疫力的增强，然而激素和抗生素的不当使用对人们的健康和安全造成了很大的困扰[11]，因而天然产物饲料添加剂的开发日益受到关注[12]，日本早在20世纪就已经开始将寡糖应用在食品和饲料添加剂中。COS是由壳聚糖降解获得的，由2～10个糖单位的糖苷键链接而成的寡聚物，在抗炎、抗肿瘤、促生长、增强免疫等方面均表现出良好的生物活性功能。本研究将COS添加到仔猪饲料中，检测COS可能对仔猪免疫性能产生的影响，并尝试推测其作用机制，以便为其在畜牧业的应用研究提供一定的参考。

本文主要对饲料中添加COS对仔猪胸腺、脾脏免疫酶活力的影响进行了检测。NOS是催化L-精氨酸与O2生成NO的合成酶，研究表明NO的降低与衰老和众多老年疾病有关。cNOS主要分布在内皮组织和神经系统，负责基础NO的合成，调节各种生理功能。iNOS在受到脂多糖等刺激后会大量释放非生理浓度的NO，产生一系列病理作用。从试验结果来看，COS对仔猪胸腺NOS活力有显著的提升作用。并且鉴于对胸腺NOS活力良好的作用效果，本文进一步对样本NOS分型活力进行了检测，结果发现胸腺cNOS活力得到大幅提升，于是本文认为COS可能主要是通过提升cNOS活力来促进总NOS活力的提升。羟自由基的化学性质十分活跃，能攻击细胞内的有机酸产生有毒的过氧化物，侵害体内的核酸、蛋白质等引起一系列细胞破坏作用。而CAT可以分解这种羟自由基，保护机体稳定的内环境。试验结果显示，COS组仔猪胸腺和脾脏的CAT活力均有一定程度的提升，其中胸腺的CAT活力提升程度极为显著，由此可见，COS可以通过提升仔猪免疫器官内CAT活力来提升其免疫能力。

综上，将COS作为免疫增强剂添加到饲料中能够对仔猪的免疫性能产生一定范围的影响，推测其作用途径可能是通过提升仔猪的免疫器官的免疫酶活力来实现的。