黄连素抑制人喉癌Hep-2细胞增殖及机制研究

黄连素抑制人喉癌Hep-2细胞增殖及机制研究

李蕾,丁小青,周建业,周卫东,汤夏冰*

(南京医科大学附属无锡人民医院，江苏 无锡 214023)

摘要：目的探讨黄连素对人喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用及其可能机制。方法体外培养Hep-2细胞，使用不同浓度黄连素诱导不同时间，应用MTT法检测细胞增殖抑制率；流式细胞术测定细胞周期及凋亡；实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)法分别检测细胞周期蛋白D(CyclinD)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因和蛋白表达水平。结果与0 μmol/L黄连素对照组比较，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黄连素作用Hep-2细胞24、48 h，可明显抑制细胞增殖，且呈浓度时间依赖性(P<0.05)；2.5、5.0、10.0 μmol/L黄连素作用 Hep-2细胞48 h，细胞早期凋亡率明显升高，呈浓度依赖性(P<0.05)；G0/G1期细胞增多(P<0.05)，诱导细胞阻滞于G0/G1期；10μmol/L黄连素作用Hep-2细胞48 h，Bax基因和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，CyclinD、Bcl-2基因和蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论黄连素能抑制喉癌细胞增殖，引起G0/G1期阻滞，并诱导其凋亡，其作用机制可能与Bax基因表达上调及CyclinD、Bcl-2基因表达下调有关。

关键词：黄连素；喉癌；细胞增殖

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.004

中图分类号：R767文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2015)06-1109-03

基金项目:南京医科大学科技发展基金(2013NJMU161, 2013NJMU167)。

作者简介:李蕾(1986-)，女，硕士研究生，主要从事喉癌的基础与临床研究。

收稿日期:(2015-04-20)

*通信作者:汤夏冰，电话-15861598912,电子信箱-txbny@sina.com

Berberine on proliferation of human laryngeal Hep-2 carcinoma cells

LI Lei, DING Xiaoqing, ZHOU Jianye, ZHOU Weidong, TANG Xiabing*

(Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi 214023,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of berberine on proliferation of human laryngeal Hep-2 carcinoma cells and its possible mechanism. MethodsThe Hep-2 cells were treated with different concentrations of berberine for different hours, the proliferation inhibitory rates were detected by MTT assay; the cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry; the levels of CyclinD, Bcl-2 and Bax were measured by real-time PCR and Western blot. ResultsThe proliferation inhibition rates of Hep-2 cells treated with 2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L berberine for 24 and 48 hours were increased compared with 0μmol/L group in concentration-and time-dependent manners (P<0.05). The early apoptotic rate was increased in concentration-dependent manner (P<0.05), and the proportion of cells in G0/G1 phase was increased after treated with 2.5, 5.0, 10.0 μmol/L berberine for 48 hours (P<0.05). The levels of Bax mRNA and protein expression significantly increased (P<0.05), while the levels of CyclinD and Bcl-2 expression significantly decreased (P<0.05). ConclusionBerberine can inhibit proliferation, and induct cell cycle G0/G1 arrest and apoptosis of Hep-2 cells probably via upregulation of Bax and downregulation of CyclinD and Bcl-2 mRNA and protein expression.

Keywords:berberine; laryngeal carcinoma; cell proliferation

黄连素又称小檗碱，属于异喹啉类生物碱，是一种传统的中医消炎及抗菌药物。研究[1-12]表明，黄连素在肝癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等多种肿瘤中有抗癌作用。但在喉癌发生、发展中的作用及调控机制尚未见报道。本研究以人喉癌Hep-2细胞作为研究对象，体外研究黄连素对Hep-2细胞增殖的影响及其可能机制，为黄连素的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料人喉癌细胞株Hep-2购自中国典型培养物保藏中心；MEM培养液购自Hyclone公司；黄连素、MTT购自Sigma公司；细胞周期、Annexin V-FITC、细胞凋亡检测试剂盒、蛋白质免疫印迹(Western blot)相关试剂购自碧云天公司；Trizol、逆转录试剂盒PrimeScript RT及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)试剂盒SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa公司，细胞周期蛋白D(CyclinD)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) PCR引物由TaKaRa公司合成。1.2细胞培养人喉癌细胞株Hep-2使用含10% FBS MEM培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。1.3MTT法分析取对数生长期的Hep-2细胞按每孔5×103个接种于96孔板中培养,培养24 h后，加入不同浓度2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黄连素的完全培养液200 μL，每组药物浓度设3个复孔，同时设不加黄连素的对照组(含0.1% DMSO完全培养液)和不接种细胞的空白孔，分别培养24、48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室温下振荡10 min，使产生的结晶紫完全溶解。在酶标仪上于490 nm波长处测定各孔的光密度值(OD值)。以空白孔调零。细胞增殖抑制率=[1-OD(实验组)/OD(对照组)]×100%。1.4细胞周期测定取对数生长期的Hep-2细胞接种于6孔板中培养，24 h后加入无血清MEM培养液培养24 h，使之同步化，然后加入不同浓度2.5、5.0、10.0 μmol/L黄连素的完全培养液培养48 h后，经胰酶消化，吹匀的细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，用预冷的PBS洗涤细胞1次，加入预冷70%乙醇固定细胞，轻轻吹匀，4 ℃固定24 h。1 000 r/min离心5 min，沉淀细胞,用预冷的PBS洗涤细胞，每管细胞样品中加入0.5 mL按说明书配制的碘化丙啶(PI)染色液，重悬细胞沉淀，37 ℃避光温浴30 min。用流式细胞仪检测，采用适当分析软件进行细胞周期分析。以不加黄连素的细胞作为对照组。1.5细胞早期凋亡测定分组同细胞周期测定，培养48 h后，收集细胞培养液，用PBS洗涤细胞，经胰酶消化，吹匀细胞的细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，用PBS重悬细胞，取10万重悬的细胞，1 000 r/min离心5 min，加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC，混匀。室温避光孵育10 min。1 000 r/min离心5 min，加入190 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入10 μL PI染色液，混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。以不加黄连素的细胞作为对照组。1.6CyclinD、Bax、Bcl-2 mRNA水平检测采用Real-time CR法检测。按照 Trizol说明书提取10.0 μmol/L黄连素作用后48 h细胞总RNA。根据Prime Script RT reagent Kit试剂盒说明书进行逆转录反应。CyclinD上游引物为5’- CACGGCTCACGCTTACCTCA-3’，下游引物为5’-ACTTGCGCGTCACAGGACAG-3’； Bax上游引物为5’- TGCGTCCACCAAGAAGCTGA-3’，下游引物为5’-AACATGTCAGCTGCCACTCG-3’； Bcl-2上游引物为5’- CTTCAGAGACAGCCAGGAGA-3’，下游引物为5’-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3’；GAPDH上游引物为5’-AACGGATTTGGTCGTATTG- 3’，下游引物为5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。以2-△△Ct表示各组 mRNA相对量。以不加黄连素的细胞作为对照组。1.7CyclinD、Bax、Bcl-2 蛋白水平检测采用Western blot法检测。用RIPA细胞裂解液裂解10.0 μmol/L黄连素作用后48 h细胞总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，根据Marker位置剪膜，分别加入兔抗人CyclinD、Bcl-2、Bax多克隆抗体、兔抗人β-actin 多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化学发光显色，胶片显影, 扫描胶片后用凝胶图像分析系统测光密度值。蛋白相对表达水平是各组光密度值与相应β-actin光密度值的比值。以不加黄连素的细胞作为对照组。1.8统计学方法应用SPSS 18.0统计软件分析，数据以均数±标准差(±s)表示，2组间比较采用双侧t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1黄连素对Hep-2细胞增殖的影响与0 μmol/L黄连素的对照组比较，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黄连素作用24、48 h对Hep-2细胞的增殖抑制率均明显升高(P<0.05)，随着时间的延长，不同浓度黄连素的增殖抑制率逐渐增强(P<0.05)，黄连素抑制Hep-2细胞增殖呈浓度时间依赖性。2.2黄连素对Hep-2细胞周期和细胞早期凋亡的影响2.5、5.0、10.0 μmol/L黄连素作用Hep-2细胞48 h，与0 μmol/L黄连素的对照组比较，随着黄连素浓度的增加，G0/G1期细胞增多(P<0.05)，细胞阻滞于G0/G1期。 2.5、5.0、10.0μmol/L黄连素作用Hep-2细胞48 h，细胞的早期凋亡率分别为(1.73±0.15)%、(6.27±0.15)%、(13.2±0.20)%，与0 μmol/L黄连素的对照组(0.83±0.06)%比较，Hep-2细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.05)，呈浓度依赖性(P<0.05)。2.3黄连素对Hep-2细胞CyclinD、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响与0 μmol/L黄连素的对照组比较，10 μmol/L的黄连素作用48 h，Bax mRNA和蛋白表达量明显增加(P<0.05)。CyclinD、Bcl-2 mRNA和蛋白表达量明显减少(P<0.05),见表1。

表1　黄连素对Hep-2细胞Cyclin D、Bcl-2、Bax mRNA 表达的影响( ± s)

表1　黄连素对Hep-2细胞Cyclin D、Bcl-2、Bax mRNA 表达的影响( ± s)

组 别CyclinDBcl-2Bax10μmol/L黄连素组0.49±0.02#0.71±0.02#1.65±0.10#对照组 1.00±0.05 1.00±0.06 1.00±0.05

注：与对照组比较，#P<0.05

3讨论

本研究显示，黄连素对人喉癌Hep-2细胞增殖有明显抑制作用，呈浓度时间依赖性。黄连素能影响Hep-2细胞内DNA的复制和合成，抑制细胞的正常分裂，抑制细胞进入S期，从而使Hep-2细胞阻滞于G0/G1期，抑制肿瘤细胞的增殖。黄连素作用Hep-2细胞的早期凋亡率也升高，且呈浓度依赖性，说明黄连素可通过细胞促进周期阻滞和抑制凋亡从而抑制细胞的增殖。黄连素抑制肿瘤细胞增殖的机制可见相关报道[13-15]。 Bcl-2家族在细胞凋亡中起着重要作用。Bcl-2主要通过与Bax形成二聚体发挥作用，二者的比例决定细胞发生凋亡与否。CyclinD是调控细胞由G1期进入S期，促进分裂增殖的关键周期蛋白，其检测出来的含量能初步反映整个细胞群的增殖活跃的程度。笔者通过对黄连素抑制喉癌细胞增殖机制的研究，发现黄连素上调了促凋亡蛋白Bax的基因和蛋白水平，下调了周期蛋白CyclinD、抗凋亡蛋白Bcl-2的基因和蛋白水平。 综上所述，黄连素作为一种天然的中药提取物，对喉癌Hep-2细胞增殖有抑制作用，其机制可能与诱导细胞G1期阻滞，上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2及CyclinD蛋白表达，从而促进凋亡有关。黄连素对喉癌细胞的抑制作用可能还体现在迁移、侵袭等方面，有待进一步研究中。黄连素有望成为治疗喉癌的有效化疗药物。

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