灵芝多糖对癫痫大鼠脑中谷氨酸转运体的影响

·实验研究·

灵芝多糖对癫痫大鼠脑中谷氨酸转运体的影响

朱孔利，谢莉莉，刘辉

(南通卫生高等职业技术学校 ，江苏 南通 226007)

摘要：目的观察和探讨灵芝多糖干预后戊四氮(PTZ)致痫大鼠皮质和海马区兴奋性谷氨酸转运体(EAAT)GLAST (EAAT1)、GLT1 (EAAT2)、EAAC1(EAAT3)的变化,进一步研究癫痫的发病机制及灵芝多糖的作用机制。方法SD大鼠32只,随机分为正常对照组、癫痫模型组、灵芝多糖组和卡马西平组,每组8只。癫痫组、灵芝多糖组和卡马西平组采用PTZ腹腔注射制作慢性癫痫点燃模型。实验结束后断头迅速取脑,采用免疫组化法检测皮质和海马区各指标的变化。结果癫痫模型组大鼠脑中GLAST、GLT1、 EAAC1的表达较正常对照组降低：皮质(31.87±4.76)、( 48.00±5.34),( 42.87±4.01)、( 52.12±3.75),( 40.25±2.81)、(46.87±3.04)；海马:(29.87±4.32)、( 44.51±4.81), (36.50±3.02)、( 47.00±3.20),( 35.62±3.42)、(42.12±3.56)；灵芝多糖和卡马西平组大鼠脑中GLAST1、GLT1、 EAAC1的表达较癫痫模型组升高:皮质(40.50±4.47)、( 31.87±4.76),( 48.87±3.48)、( 42.87±4.01),( 43.87±2.53)、(40.25±2.81)；海马:(37.75±3.61)、( 29.87±4.32),( 41.25±2.60)、 (36.50±3.02),( 39.50±2.61)、(35.62±3.42)。灵芝多糖组和卡马西平组之间GLAST1、GLT1、EAAC1三者的表达无统计学意义。结论灵芝多糖能够升高癫痫大鼠脑中GLAST、GLT1、EAAC1的表达，加速了兴奋性氨基酸Glu(谷氨酸)的清除。降低神经元兴奋性、减少神经系统损伤而抑制癫痫的发作。

关键词：癫痫；谷氨酸转运体；灵芝多糖

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.002

中图分类号：R285．5文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2015)06-1104-03

基金项目：江苏省卫生科研项目(JZ201319)。

作者简介：朱孔利(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事癫痫的发病机制及预防研究。

收稿日期:(2015-05-26)

Ganoderma lucidum polysaccharide on excitatory amino acid transporter in brain of epileptic rat

ZHU Kongli, XIE Lili, LIU Hui

(Nantong Vocational and Technical College of Health, Nantong 226007, Jiangsu Province, China)

Abstract：ObjectiveTo observe and investigate the influence of ganoderma lucidum polysaccharide on GLAST, GLT-1 and EAAC1 in the cortex and hippocampus of epileptic rat. Study on the pathogenesis of epilepsy and the mechanism of action of ganoderma lucidum polysaccharide. MethodsThe 32 SD rats were randomly divided into normal control group, epilepsy model group, ganoderma lucidum polysaccharides and carbamazepine group, each group of eight. The rats of epilepsy model group, ganoderma lucidum polysaccharides and carbamazepine group made by intraperitoneal injection of pentetrazole (PTZ). After the experiment, get the rats brain tissue quickly. Using immunohistochemical and colorimetry to detect the index changes of cortex and hippocampus. ResultsGLAST1，GLT1， EAAC1 in the brain of epileptic rat lower in epilepsy model group than the normal control group:cortex(31.87±4.76),( 48.00±5.34),(42.87±4.01),(52.12±3.75),(40.25±2.81),(46.87±3.04);hippocampus(29.87±4.32),(44.51±4.81), (36.50±3.02),(47.00±3.20), (35.62±3.42),(42.12±3.56); GLAST, GLT-1, EAAC1 in the brain of epileptic rat higher in ganoderma lucidum polysaccharides group and carbamazepine group than the epilepsy model group:cortex(40.50±4.47),(31.87±4.76),(48.87±3.48),(42.87±4.01),(43.87±2.53),(40.25±2.81);hippocampus(37.75±3.61),(29.87±4.32),( 41.25±2.60),(36.50±3.02),(39.50±2.61),(35.62±3.42); GLAST1, GLT1, EAAC1 were no significant differences in ganoderma lucidum polysacchairides group and carbamazepine group. ConclusionGanoderma lucidum polysaccharide can increase the GLAST，GLT-1 and EAAC1 in the epileptic rats brain tissue, speed up the process of eliminating glutamic acid.

Keywords：epilepsy; EAAT; Ganoderma lucidum polysaccharide

癫痫是临床上常见的神经系统疾病之一，脑部最主要的兴奋性神经递质 Glu(谷氨酸)的升高在癫痫发生中起一定作用，可导致神经元细胞凋亡。而细胞外Glu 的清除主要依赖于高亲和力的兴奋性氨基酸转运体(EAATs)。迄今为止已克隆出5种位于细胞膜的兴奋性谷氨酸转运体(EAAT)，分 别 为 GLAST(EAAT1)、GLT-1 (EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4、EAAT5。灵芝含有丰富的氨基酸和微量元素，可通过免疫调节，抗氧化，清除自由基，抑制凋亡，增强学习记忆，营养神经等方面发挥抗癫痫作用。灵芝多糖由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物，是灵芝主要有效成分之一[1]，本实验拟研究灵芝多糖对癫痫大鼠大脑中GLAST、GLT1、EAAC1的影响，进一步探讨癫痫的发病机制及灵芝多糖的作用机制。

1材料与方法

1.1材料1.1.1动物雄性SD大鼠32只(鼠龄12周)，体质量180～220 g，普通级动物，由南通大学医学院动物实验中心提供。1.1.2主要仪器与试剂戊四氮(PTZ)：美国sigma公司；灵芝多糖：上海康舟真菌多糖有限公司；兔抗大鼠GLAST、兔抗大鼠GLT-1和兔抗大鼠EAAC1均购自武汉博士德生物工程公司；成像系统：BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟生物科技公司)。1.2方法1.2.1癫痫模型及动物处理大鼠适应喂养3 d后，随机分为4组，分别为正常对照组、癫痫模型组、灵芝多糖组和卡马西平组。灌胃前禁食6 h。癫痫模型组PTZ腹腔注射加生理盐水灌胃；灵芝多糖组PTZ腹腔注射加灵芝多糖灌胃；卡马西平组PTZ腹腔注射加卡马西平混悬液灌胃；正常对照组生理盐水腹腔注射加生理盐水灌胃。腹腔注射剂量为35 mg/kg，灵芝多糖灌胃剂量为150 mg/kg，1 次/d，卡马西平灌胃计量为15 mg/kg的混悬液，2次/d，持续28 d。观察大鼠的行为变化，记录癫痫发作情况。按照惊厥发作评分标准[2]，凡显示连续5次Ⅱ级以上惊厥的大鼠为达到点燃标准。1.2.2免疫组织化学检测 实验动物麻醉后心脏灌注断头，取脑，甲醛固定、包埋、切片、封片，用于免疫组化。SABC法检测皮质和海马区GLAST、GLT-1和EAAC1的免疫反应性;正常组实验省去第Ⅰ抗，以PBS代替，孵育切片。光镜下观察 ，胞膜显示棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张切片选择 5 个具有代表性的高倍视野(×400)，计算染色的阳性细胞数。1.2.3统计学处理实验中所得数据均以平均数±标准差(±s)表示，均数间显著性差异判定使用SPSS Statistics 17．0统计软件包进行分析。

2结果

2.1行为学观察实验过程中，癫痫模型组、灵芝多糖组和卡马西平组实验大鼠均有连续多次的Ⅱ～IV级癫痫发作，均达到点燃标准，癫痫模型制作成功。初期大鼠的癫痫发作基本上每次腹腔注射戊四氮后1～3 min出现，5～7 min 达到高峰，一般30 min后很少再有抽搐发作。灵芝多糖组和卡马西平组大鼠癫痫发作潜伏期明显延长，发作时间缩短。正常对照组生理盐水腹腔注射及灌胃前后无明显变化。2.2各组皮质和海马区GLAST的表达见表1。

表1　大鼠大脑皮质和海马区GLAST阳性细胞数比较( ± s, n=8)个/高倍视野

表1　大鼠大脑皮质和海马区GLAST阳性细胞数比较( ± s, n=8)个/高倍视野

组 别皮 质海 马正常组48.00±5.34##44.51±4.81##模型组31.87±4.76 29.87±4.32 灵芝组40.50±4.47# 37.75±3.61# 卡马组38.12±4.22# 35.62±3.06#

注：与模型组比较，#P<0.05; ##P<0.01

2.3各组皮质和海马区GLT-1的表达见表2。

表2　大鼠大脑皮质和海马区GLT-1阳性细胞数比较( ± s, n=8)个/高倍视野

表2　大鼠大脑皮质和海马区GLT-1阳性细胞数比较( ± s, n=8)个/高倍视野

组 别皮 质海 马正常组52.12±3.75##47.00±3.20##模型组42.87±4.01 36.50±3.02 灵芝组48.87±3.48# 41.25±2.60# 卡马组46.12±4.85# 38.12±3.09#

注：与模型组比较，#P<0.05; ##P<0.01

2.4各组皮质和海马区EAAC1的表达见表3。

表3　大鼠大脑皮质和海马区EAAC1阳性细胞数比较( ± s, n=8)个/高倍视野

表3　大鼠大脑皮质和海马区EAAC1阳性细胞数比较( ± s, n=8)个/高倍视野

组 别皮 质海 马正常组46.87±3.04##42.12±3.56##模型组40.25±2.81 35.62±3.42 灵芝组43.87±2.53# 39.50±2.61# 卡马组44.62±2.13# 40.75±2.43#

注：与模型组比较，#P<0.05; ##P<0.01

3讨论

谷氨酸转运体与癫痫发作密切相关。用遗传学手段高表达或者药理学手段上调GLT-1的表达和功能可以增加谷氨酸的摄取能力并减轻谷氨酸引起的细胞死亡[3]。乳酸转运体的减少可引起谷氨酸转运体(EAAT1)的减少，导致脑内谷氨酸水平升高，提高神经元兴奋性，导致癫痫发作[4]。研究[5]发现，星形胶质细胞中TSC1失活的小鼠脑中的GLT-1和GLAST蛋白量都明显降低，同时表现出癫痫行为，可能是由于TSC1的失活导致谷氨酸转运系统的紊乱，引起癫痫发作。7β-羟基胆固醇可抑制海马区域胶质细胞增生、提高 GLAST 和 GLT1的表达，对创伤性癫痫起到治疗作用[6]。癫痫大鼠颞叶皮层中 GLAST 和 GLT-1 在静息期表达水平下调，严重影响 Glu 的清除机制，二者可能共同参与癫痫发生过程中的突触重构，引起癫痫敏感性增加。癫痫持续状态的大鼠海马神经元遭受损伤，TBOA可阻滞GLAST 、GLT1和EAAC1 ，导致谷氨酸转运体功能障碍，加重神经元损伤，对海马区突触的可塑性产生影响[7]。研究[8]显示，EAAC1 在急性期和静息期早期表达增加。而 SIMANTOV等[9]发现在癫痫大鼠海马中 EAAC1 mRNA 及蛋白在癫痫早期表达呈下降趋势。SEPKUTY等[10]研究证实大鼠 EAAC1 基因敲除后，导致Glu 转运障碍，促使癫痫发生。Guo 等[11]发现 EAAC1 蛋白及 mRNA 的表达在SERs中无明显变化。 本研究发现，戊四氮致癫痫大鼠皮质和海马区GLAST、GLT-1、 EAAC1的表达水平明显低于正常组，用灵芝多糖和卡马西平干预的大鼠皮质和海马区GLAST、GLT-1、 EAAC1的表达水平较癫痫模型组明显升高，灵芝多糖组和卡马西平组之间GLAST、GLT-1、EAAC1三者的表达无统计学意义。同时行为学显示：癫痫大鼠发作的潜伏期明显延长，发作时间缩短，说明灵芝多糖可能通过升高GLAST、GLT-1、 EAAC1的表达来降低神经元兴奋性，减轻或抑制癫痫发作。

参考文献：

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[10]SEPKUTY J P, COHEN A S, ECCLES C, et al. A neuronal glutamate transporter contributes to neurotransmitter GABA synthesis and epilepsy[J]. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2002, 22(15): 6372-6379.

[11]GUO Feng, SUN Feng, YU Junling, et al. Abnormal expressions of glutamate transporters and metabotropic glutamate receptor 1 in the spontaneously epileptic rat hippocampus[J]. Brain Research Bulletin, 2010, 81(4/5): 510-516.